王 楠，高 靜，黃文靜，李 鉑，唐志書，宋忠興(.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 7083； .陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 7046)

Tang Zhi-shu E-mail:tzs6565@163.com

黃芪在中國藥典中規(guī)定為豆科草本植物膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus)或蒙古黃芪(A.membranaceusvar.mongholicus)的干燥根[1]。黃芪產(chǎn)地分布廣泛，甘、陜、川、晉、蒙和東北等地均有種植[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論和實踐認為，黃芪具有益氣升陽、行氣利水、固表止汗等作用[3]，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究和化學(xué)分析證實,黃芪含有皂苷、多糖、黃酮、氨基酸、葉酸、膽堿等多種化學(xué)成分及微量元素，更加深入的藥理研究則闡明黃芪具有增強免疫力、抗衰老、抗腫瘤、降血糖等功效[4]，可以應(yīng)用于治療多種病癥并取得較好的臨床效果。隨著對黃芪臨床應(yīng)用方面研究的不斷深入，黃芪應(yīng)用范圍也在不斷擴展，從而導(dǎo)致對黃芪的需求也逐年增多。

隨著社會發(fā)展，工業(yè)給人類帶來福祉的同時也帶來了負面影響。環(huán)境破壞、土壤污染與退化問題日益凸顯，干旱和鹽漬化成為制約生態(tài)系統(tǒng)健康的關(guān)鍵問題之一。種子順利萌發(fā)是生態(tài)系統(tǒng)重要的組成環(huán)節(jié)。干旱和土壤鹽堿化阻礙種子萌發(fā)且對胚的生長發(fā)育產(chǎn)生不良影響[5-6]。近年來，有關(guān)干旱和鹽脅迫影響黃芪種子萌發(fā)的研究已有大量報道[7-13]，但這類研究均僅選擇膜莢黃芪或蒙古黃芪之一作為研究對象，沒有將二者放入同一試驗環(huán)境中進行對比。膜莢黃芪屬于森林草甸中生植物，而蒙古黃芪則屬于旱中生植物[14]，原初適生環(huán)境的不同能導(dǎo)致應(yīng)對同類脅迫時響應(yīng)不同。因此，研究兩種黃芪種子應(yīng)對干旱和鹽脅迫時的差異化現(xiàn)象能為今后在環(huán)境氣候漸變趨勢下的選種育種工作提供理論支撐。此外，目前只有極個別研究探索植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)物質(zhì)——水楊酸(salicylic acid, SA)如何影響黃芪種子萌發(fā)[15-16]，而SA對黃芪種子的抗逆性是否有促進作用也鮮見報道。

種子萌發(fā)受到內(nèi)部生理和外部環(huán)境的雙重調(diào)控，其生長模式常被用作表征種子生活力和抗逆性的重要指示因子。因此，以膜莢黃芪和蒙古黃芪為材料，研究兩種黃芪種子的萌發(fā)趨勢和幼苗發(fā)育在等滲壓力的干旱和鹽脅迫梯度下響應(yīng)方式的異同，探索兩種黃芪在干旱和鹽脅迫下的耐受性差異，為兩種黃芪響應(yīng)生境惡化提供理論支持；重度脅迫下兩種黃芪種子對外源SA施用形式的響應(yīng)異同，篩選有效緩解旱/鹽害、提高黃芪幼苗耐受性的最適SA濃度及施用方式，促進黃芪資源在漸變環(huán)境尺度下的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

膜莢黃芪和蒙古黃芪種子均采收于甘肅省宕昌縣縣域內(nèi)。由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高靜老師鑒定。膜莢黃芪種子千粒重1.40 g，蒙古黃芪種子千粒重1.65 g。種子存放在干燥陰涼通風的實驗室。NaCl和PEG均為分析純。

1.2 試驗設(shè)計

選取籽粒健壯飽滿、大小均勻的足量膜莢黃芪和蒙古黃芪種子，用1%高錳酸鉀消毒20 min后，蒸餾水沖洗至凈，去除種子表面浮水后待用。

用PEG6000(此后簡稱PEG)和NaCl溶液模擬干旱脅迫和鹽脅迫。試驗1:干旱和鹽脅迫對兩種黃芪種子萌發(fā)的影響。分別將PEG和NaCl按溶解濃度配制成5個水勢脅迫梯度，即對照0(CK)，-0.1，-0.3，-0.5，-0.7 MPa。試驗2:重度干旱和鹽脅迫下SA及其施用方式對兩種黃芪種子萌發(fā)的影響。試驗處理設(shè)定值參考預(yù)試驗結(jié)果，將發(fā)芽率只有20%左右的脅迫強度設(shè)定為研究水勢，即PEG為-0.6 MPa、NaCl為-0.9 MPa；在預(yù)試驗中當SA濃度≥0.4 mmol·L-1時對黃芪種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制，所以SA設(shè)定3個濃度，即0.1、0.2和0.3 mmol·L-1。

選擇SA拌種和浸種兩種方法。拌種:將SA分別與PEG和NaCl配制成符合研究條件水勢的溶液，加入種子發(fā)芽床，使SA始終貫穿整個處理過程。浸種:將黃芪種子浸泡于SA溶液24 h后用蒸餾水沖洗至凈后置入發(fā)芽床，此后種子不再與SA接觸。試驗在墊有兩層濾紙的90 mm培養(yǎng)皿中實施，每個培養(yǎng)皿中30粒種子，重復(fù)3次。本研究在室溫和自然光照交替下進行，以期溫度和光照不作為種子的促進或限制因素。

1.3 種子萌發(fā)指標測定

每日觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)，發(fā)芽9 d后所有處理均無新種子萌發(fā)。最終發(fā)芽率(total germination percentage，TGP)=發(fā)芽種子數(shù)/供試總種子數(shù)；發(fā)芽勢(germination energy，GE)=發(fā)芽高峰時段內(nèi)的發(fā)芽數(shù)/供試總種子數(shù)%，本研究中采用前4 d的數(shù)據(jù)；簡化活力指數(shù)(vigor index，VI)=TGP×S，S為幼苗生長勢，用萌發(fā)后第10天的幼苗平均長度表示。相對PEG或NaCl傷害率(relative damage rate，RDR)=(對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率；相對發(fā)芽率(relative germination rate，RGR)=處理發(fā)芽率/對照發(fā)芽率。

1.4 幼苗生長指標測定

萌發(fā)10 d，從各重復(fù)中隨機取出10株幼苗，測定苗長(shoot length，SL)、根長(root length，RL)、苗干重(shoot dry weight，SDW)、根干重(root dry weight，RDW)。測干重前先105 ℃烘2 h殺青，后80 ℃烘24 h至恒重。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件和IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計分析軟件對最終發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)、苗長、根長、苗重和根重進行處理和差異顯著性檢驗(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG和NaCl脅迫對膜莢黃芪和蒙古黃芪種子萌發(fā)指標的影響

與對照相比，當PEG和NaCl為-0.1 MPa時，均對膜莢黃芪種子萌發(fā)有促進作用，但對蒙古黃芪種子卻無促進作用(圖1)。當PEG和NaCl<-0.3 MPa時開始抑制膜莢黃芪種子萌發(fā)；而當PEG<-0.3 MPa和NaCl<-0.5 MPa時開始抑制蒙古黃芪種子萌發(fā)(P<0.05)。-0.1 MPa的NaCl對膜莢黃芪種子發(fā)芽勢有顯著的促進作用(P<0.05)(表1)。當PEG和NaCl<-0.3 MPa時，膜莢黃芪種子和蒙古黃芪種子的發(fā)芽勢開始下降(P<0.05)。當PEG和NaCl為-0.1 MPa時，膜莢黃芪種子的簡化活力指數(shù)不受影響；NaCl為-0.1 MPa時，蒙古黃芪種子的簡化活力指數(shù)不受影響(P>0.05)。其他處理下，兩種黃芪種子的簡化活力指數(shù)均下降(P<0.05)?？傮w而言，隨著脅迫的增強，兩種黃芪種子的最終發(fā)芽率，發(fā)芽勢和簡化活力指數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢。

圖1 膜莢黃芪種子在PEG、NaCl脅迫下和蒙古黃芪種子在PEG、NaCl脅迫下的累積發(fā)芽率Fig. 1 The cumulative germination of A. membranaceus under PEG and NaCl stresses and A. membranaceus var. mongholicus under PEG and NaCl stresses

2.2 PEG和NaCl脅迫對膜莢黃芪和蒙古黃芪幼苗生長發(fā)育的影響

全部PEG脅迫和NaCl<-0.3 MPa時，對膜莢黃芪幼苗長顯著抑制(P<0.05)(表1)；PEG和NaCl都<-0.1 MPa時對蒙古黃芪幼苗長顯著抑制。當PEG<-0.1 MPa和NaCl<-0.3 MPa時，對膜莢黃芪和蒙古黃芪根長顯著抑制(P<0.05)。上述抑制作用均隨脅迫強度加劇而增加。不同處理對種子萌發(fā)和生長的促進或抑制通過相對傷害率值體現(xiàn)。當PEG和NaCl為-0.1 MPa時對膜莢黃芪種子有益，當NaCl為-0.1 MPa時對蒙古黃芪種子無害。其他處理下，隨著PEG和NaCl脅迫強度不斷增加，對兩種黃芪種子的傷害程度也在不斷加劇。如圖2所示，膜莢黃芪和蒙古黃芪幼苗及根部干重均隨PEG和NaCl脅迫強度增加而減少。兩種黃芪苗干重相對下降幅度基本一致，而根干重下降變化存在差異。在-0.5 MPa PEG和-0.7 MPa NaCl脅迫下，膜莢黃芪根部干重下降幅度多于蒙古黃芪。

2.3 水楊酸對重度PEG和NaCl脅迫下膜莢黃芪和蒙古黃芪種子萌發(fā)的影響

如圖3所示，對于兩種黃芪而言，水楊酸(SA)在促進重度PEG和NaCl脅迫下種子萌發(fā)均是浸種方式要好于拌種方式。重度PEG脅迫下，膜莢黃芪種子在0.1、0.2和0.3 mmol·L-1SA拌種處理下，發(fā)芽率分別是15%、9%和8%，均小于重度PEG脅迫對照發(fā)芽率(17%)；而在SA浸種處理下，發(fā)芽率分別是76%、70%和83%，接近空白對照水平(88%)。重度NaCl脅迫下，膜莢黃芪種子在0.1、0.2和0.3 mmol·L-1拌種處理下，發(fā)芽率分別是21%、22%和11%，前兩個處理與重度NaCl脅迫對照發(fā)芽率(21%)無顯著差異(P>0.05)，最后的處理顯著小于脅迫對照(P<0.05)；而在SA浸種處理下，發(fā)芽率分別是6%、34%和43%，顯著高于重度NaCl脅迫對照發(fā)芽率(21%)。重度PEG脅迫下，蒙古黃芪在3種SA濃度的拌種處理下，發(fā)芽率分別是7%、9%和0，均顯著小于重度PEG脅迫對照發(fā)芽率(18%)；而在SA浸種處理下，發(fā)芽率分別是84%、54%和1%，0.1 mmol·L-1SA浸種處理達到空白對照水平(82%)。重度NaCl脅迫下，蒙古黃芪在3種SA濃度的拌種處理下，發(fā)芽率分別是12%、12%和14%，與重度NaCl脅迫對照發(fā)芽率(14%)無顯著差異；而在SA浸種處理下，發(fā)芽率分別是29%、30%和43%，顯著高于重度NaCl脅迫對照發(fā)芽率(14%)。

表1 PEG和NaCl對膜莢黃芪種子和蒙古黃芪種子的最終發(fā)芽率、發(fā)芽勢、簡化活力指數(shù)、苗長、根長、相對傷害率和相對發(fā)芽率的影響Table 1 Total germination percentage (TGP), germination energy (GE), vigor index (VI), shoot length (SL), root length (RL), relative damage rate (RDR) and relative germination rate (RGR) of A. membranaceus (A) and A. membranaceus var. mongholicus (AM) under PEG and NaCl stresses

不同小寫字母表示相同品種不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters in the same variety show significant differences among different treatments at the 0.05 level.

圖2 PEG和NaCl脅迫對膜莢黃芪和蒙古黃芪的苗干重和根干重的影響Fig. 2 The shoot dry weight and root dry weight of A. membranaceus and A. membranaceus var. mongholicus under PEG and NaCl stresses

不同小寫字母和大寫字母分別表示膜莢黃芪和蒙古黃芪在不同脅迫下干重差異顯著性(P<0.05)。

Different lowercases and capital letters indicate significant differences among different treatments of dry weight ofA.membranaceusandA.membranaceusvar.mongholicusat the 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)時遭受到干旱和鹽脅迫，其膜系統(tǒng)、酶活性和生理代謝過程均會發(fā)生變化[17-20]。本研究結(jié)果符合前人總結(jié)趨勢，最終發(fā)芽率、發(fā)芽勢、簡化活力指數(shù)、苗長、根長、苗干重和根干重均隨PEG和NaCl脅迫強度的增加而下降。

膜莢黃芪種子和蒙古黃芪種子在輕微干旱和鹽脅迫下有不同的響應(yīng)方式。PEG和NaCl均為-0.1 MPa時對膜莢黃芪種子的萌發(fā)具有促進作用。適度干旱能夠促進種子萌發(fā)已在多種植物包括膜莢黃芪上被證實[7,21-22]，有觀點認為其作用機理可以從種子吸脹過程中防止膜損傷加快膜修復(fù)的膜系統(tǒng)保護機制和加速新陳代謝及核酸產(chǎn)生的酶活性角度于以解釋[23]。低濃度NaCl對膜莢黃芪種子萌發(fā)具有促進作用也已有報道，其原因被推測為低濃度NaCl溶液提供了適宜濃度的離子從而激活部分酶活性或是由于Na+進入到種子中，降低了水勢，從而促進吸脹吸水[10,18]。同時，也有研究報道了低濃度PEG或NaCl也能促進蒙古黃芪種子萌發(fā)[8-9]。但是，在本研究中，蒙古黃芪種子置于-0.1 MPa的PEG和NaCl下均無促進作用。楊祎辰等[9]使用不同濃度PEG處理蒙古黃芪種子24～48 h后隨即停止脅迫，韓多紅等[8]使用NaCl+Na2CO3混合溶液對蒙古黃芪種子進行處理，這與本研究所使用的持續(xù)PEG脅迫和NaCl單一處理有著本質(zhì)不同。蒙古黃芪作為一種旱中生植物，它的適生地時常遭遇輕度干旱和鹽堿脅迫，那么它的種子能否被低濃度PEG或NaCl所影響或者不受脅迫所影響的濃度范圍是多少還需要進一步地研究。

圖3 水楊酸拌種(MS)和浸種(SS)處理對膜莢黃芪種子在重度PEG、重度NaCl脅迫下和蒙古黃芪種子在重度PEG、重度NaCl脅迫下的發(fā)芽率Fig. 3 The germination rate of A. membranaceus under severe PEG and severe NaCl stresses and A. membranaceus var. mongholicus under severe PEG and severe NaCl stresses between mixing seed with SA (MS) and soaking seed with SA (SS)

在本研究中，隨著高濃度PEG和NaCl的施用，兩種黃芪種子的最終發(fā)芽率、發(fā)芽勢、簡化活力指數(shù)、苗長、根長、苗干重和根干重均被明顯抑制。在-0.5 MPa PEG和-0.7 MPa NaCl下，兩種黃芪種子的耐受性差異明顯，蒙古黃芪種子萌發(fā)及苗長和根長較對照的下降幅度顯著小于膜莢黃芪種子較對照的下降幅度(P<0.05)。因此，蒙古黃芪作為旱中生植物，其旱/鹽耐受力要強于膜莢黃芪。本研究中，雖然PEG和NaCl均能抑制兩種黃芪種子萌發(fā)，但是在等滲條件下，PEG的效果要強于NaCl。由于高濃度NaCl下種子的發(fā)育表現(xiàn)要好于高濃度PEG下的種子，所以可以認為NaCl提供的離子效應(yīng)在本研究中是一種正效應(yīng)或能與滲透脅迫相拮抗，從而減輕種子遭受滲透脅迫程度，其原因推測為:溶液中的Na+進入到細胞中，降低細胞水勢，從而促進吸水[18]。

目前，已有大量文獻證明適量水楊酸(SA)可以促進種子萌發(fā)且能起到緩解環(huán)境脅迫的作用[15-16,24-25]。當植物處于干旱或鹽脅迫時，水分虧缺和離子毒害會導(dǎo)致活性氧等有害物質(zhì)大量生成，細胞膜脂過氧化程度加劇和電解質(zhì)泄漏等不良生理反應(yīng)，此時植物需要通過滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)，來進行抗氧化防御，防止過度失水，清除活性氧物質(zhì)，保持生物膜的完整性[26-27]。SA能調(diào)節(jié)可溶性蛋白含量，降低膜的滲透性，提高抗氧化酶和非酶類抗氧化系統(tǒng)的活性，從而提高滲透勢，限制Na+的內(nèi)流，減少活性氧數(shù)量和緩解細胞的損傷程度[25,28]。在本研究中，采用SA浸種處理的兩種黃芪種子發(fā)芽率均顯著優(yōu)于拌種處理(P<0.05)。浸種處理能在種子獲取SA的同時進行吸脹作用獲取水分用以支持脅迫下種子的萌發(fā)；而拌種處理下，雖然SA一直都存在于溶液中，但是脅迫產(chǎn)生的抑制作用遠大于SA的補償作用。SA浸種后的兩種黃芪種子在PEG下的發(fā)芽率要高于NaCl下的發(fā)芽率，說明SA與PEG和NaCl存在不同的化學(xué)反應(yīng)。此外，膜莢黃芪種子的發(fā)芽率在PEG和NaCl下對SA的濃度差異沒有明顯的反應(yīng)；而蒙古黃芪種子的發(fā)芽率在PEG下隨著SA濃度的增加而減少，在NaCl下卻隨著SA濃度的增加有小幅上升。SA的抗性機制是通過結(jié)合其他植物激素參與的復(fù)雜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)的，不同濃度的SA在不同環(huán)境條件下對不同植物品種或器官的作用存在巨大差異[29-30]。SA也可以通過拮抗作用對植物達到保護效果[31]。PEG只具有滲透脅迫效果，而NaCl兼具滲透脅迫和離子效應(yīng)[32]，因此是否由于種子自身含有的化學(xué)物質(zhì)能與SA和NaCl發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致在不同濃度SA、PEG和NaCl下蒙古黃芪種子截然不同的萌發(fā)表現(xiàn)這一猜測還需要進一步研究。

綜上所述，雖然滲透脅迫和離子毒害對于種子的生長發(fā)育屬于逆境脅迫[33-34]，但是輕度PEG和NaCl脅迫可以在一定程度上促進膜莢黃芪種子萌發(fā)。蒙古黃芪由于適生生境的影響，其種子對干旱和鹽脅迫的耐受能力要強于膜莢黃芪種子。此外，膜莢黃芪種子和蒙古黃芪種子應(yīng)對SA處理產(chǎn)生差異化表現(xiàn)的深層次原因還需更進一步的研究。

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