楊逢源，王雁萍，趙珊珊，郭琳娜，曹 丹(鄭州大學(xué)河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

苜蓿(Medicagosativa)富含粗蛋白、粗脂肪及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是廣泛種植的經(jīng)濟(jì)牧草。劉會(huì)芳等[1]對(duì)苜蓿、小麥(Triticumaestivum)及玉米(Zeamays)經(jīng)濟(jì)效應(yīng)研究表明，現(xiàn)階段小麥和玉米處于規(guī)模報(bào)酬遞減階段而苜蓿處于規(guī)模報(bào)酬遞增階段，苜蓿產(chǎn)業(yè)有很大的上升空間。青貯是牧草貯藏的常用技術(shù)，青貯過(guò)程中，乳酸菌主要利用牧草中的可溶性糖產(chǎn)生乳酸，降低牧草的pH，防止腐敗菌大量生長(zhǎng)造成牧草中蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解。同時(shí)，飼喂青貯苜蓿對(duì)牲畜代謝能力有一定積極影響。李改英等[2]研究發(fā)現(xiàn)，與相同干物質(zhì)含量的干草相比，飼喂苜蓿青貯飼料有利于改善奶牛的生產(chǎn)性能和機(jī)體代謝能力。新鮮牧草中乳酸菌數(shù)量較低，且多為異型發(fā)酵菌株[3-4]，因此產(chǎn)酸及耐酸性能較好的同型發(fā)酵的植物乳桿菌成為牧草青貯中常用的添加劑。

然而，苜?？扇苄蕴呛枯^低，致使乳酸菌無(wú)法正常生長(zhǎng)且無(wú)法生成充足的乳酸，因此自然青貯往往無(wú)法達(dá)到理想的效果。萬(wàn)里強(qiáng)等[5]發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌的同時(shí)添加纖維素酶能夠有效提高苜蓿青貯品質(zhì)。董治國(guó)等[6]研究表明，糖蜜與復(fù)合菌共同作為添加劑，苜蓿能在較高水分下青貯。李改英等[7]研究表明，添加糖蜜明顯改善苜蓿青貯飼料的感官品質(zhì),提高其粗蛋白質(zhì)及乳酸含量,降低了銨態(tài)氮和總氮的比值以及飼料的pH。然而，直接添加外源添加劑或會(huì)增加青貯成本，同時(shí)在工業(yè)青貯中會(huì)增加操作難度。因此，提高乳酸菌分解纖維素性能有可能是解決苜蓿青貯困境的有效途徑。Ozkose等[8]將纖維素酶基因轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌IL403和MG1363中構(gòu)建重組菌株，作為青貯添加劑可有效降低其中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。這為乳酸菌轉(zhuǎn)基因工程菌的生產(chǎn)與應(yīng)用打下了良好基礎(chǔ)。本研究采用N+注入的方法對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行誘變，以期選育低可溶性糖環(huán)境中發(fā)酵產(chǎn)酸性能優(yōu)良的突變菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試劑

本研究中所用菌株如表1所列。

表1 試驗(yàn)菌株及來(lái)源Table 1 Name and origin of bacterial strains

ZZU A345分離自山西省的苜蓿樣品，具有良好的產(chǎn)酸能力，抑菌性能及葡聚糖利用能力，保存于鄭州大學(xué)離子束生物工程實(shí)驗(yàn)室。

試驗(yàn)中所用專(zhuān)門(mén)試劑及培養(yǎng)基成分：誘變保護(hù)劑(0.02%透明質(zhì)酸鈉，3%海藻糖)；MRS-CMC培養(yǎng)基為由MRS培養(yǎng)基改良的篩選培養(yǎng)基，添加1%羧甲基纖維素鈉，固體培養(yǎng)基葡萄糖含量為1%，液體培養(yǎng)基葡萄糖含量為0.4%。

1.2 誘變及篩選

1.2.1N+注入 將出發(fā)菌株于MRS-CMC固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取出發(fā)菌株于4 mL誘變保護(hù)劑中，振蕩均勻，調(diào)整菌液OD600值至0.6。吸取50 μL菌液在培養(yǎng)皿中央均勻涂布直徑約2 cm，以保證涂布面為單層細(xì)菌。

將培養(yǎng)皿上的乳酸菌進(jìn)行N+注入，劑量分別為1×1015、5×1010和1×1010ion·cm-2。向離子注入后的培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌水浸泡，用橡膠塊擦洗皿底輻照后的菌斑，將菌液吸回MRS-CMC液體培養(yǎng)基，取部分菌液稀釋涂布MRS-CMC固體培養(yǎng)基平板，統(tǒng)計(jì)致死率，其余菌液置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用于目標(biāo)菌株的分離、純化及篩選。

1.2.2輻照致死率測(cè)定 采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

致死率=(1-注入后菌落數(shù)/注入前菌落數(shù))×100%。

1.2.3菌株的篩選 對(duì)Teather的剛果紅染色法[9]進(jìn)行改良，通過(guò)添加微量葡萄糖，建立了一種更加適應(yīng)乳酸菌生長(zhǎng)情況的篩選方法：

誘變后菌株在液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h后，稀釋涂布于MRS-CMC固體培養(yǎng)基，待形成單菌落后隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行編號(hào)并擴(kuò)大培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌用牙簽點(diǎn)菌至MRS-CMC固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后用剛果紅染色，根據(jù)染色出圈直徑與菌落直徑的比值判斷菌株對(duì)纖維素的降解情況，保存透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株。

1.2.4發(fā)酵苜蓿草粉實(shí)驗(yàn) 將苜蓿放置于65 ℃烘箱48 h烘干水分，利用粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)0.069 mm篩子，制備苜蓿草粉備用。將篩選出的菌株活化后接種于MRS-CMC液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，制備乳酸菌菌液備用。稱(chēng)取苜蓿粉1 g于自封袋中，按66.7%的含水量加2 mL無(wú)菌水，在裝有上述苜蓿粉的自封袋中，以加入300 μL乳酸菌菌液的為加菌處理組，以不加菌的作為對(duì)照組(CK)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，混勻，密封，放置于30 ℃培養(yǎng)箱。分別培養(yǎng)0、24、48 h后開(kāi)封，開(kāi)封后每袋樣品中加入27 mL蒸餾水，充分混勻，測(cè)定其pH，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5纖維素酶活的測(cè)定 將供試菌株于MRS-CMC液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h后，4 000 r·min-1室溫離心10 min，用無(wú)菌水清洗后制備為500 μL菌懸液，取100 μL轉(zhuǎn)接至不含葡萄糖的MRS-CMC液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)48 h。以羧甲基纖維素鈉為反應(yīng)底物，采用DNS法[4]測(cè)定纖維素內(nèi)切酶酶活，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 苜蓿青貯試驗(yàn)

1.3.1青貯材料的準(zhǔn)備及乳酸菌的培養(yǎng) 將初花期收獲的苜蓿材料室溫晾曬至含水量約為60%，截至2～3 cm長(zhǎng)。乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)12 h。取100 g苜蓿樣品裝于自封袋中，處理組加入100 μL菌液，對(duì)照組不添加菌液，混勻后抽真空密封，置于室溫(約25 ℃)，每組樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.2青貯品質(zhì)及化學(xué)成分分析 使用AOAC法測(cè)定樣品干物質(zhì)含量。將樣品于烘箱65 ℃干燥48 h后粉碎，凱氏定氮法[10]測(cè)定其粗蛋白含量(海能K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀)。取10 g樣品與90 mL水混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定其有機(jī)酸成分(Alliance，Waters e2695)。有機(jī)酸種類(lèi)及含量采用高效液相色譜法測(cè)定[10]。柱子規(guī)格：Carbomix H-NP 10 μm，8%，7.8 mm×300 mm)，流動(dòng)相為0.0254%的硫酸，流速為0.6 mL·min-1，柱溫55 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和均值統(tǒng)計(jì)，并通過(guò)SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 輻照致死率

出發(fā)菌株ZZU A345在不同劑量N+輻照下致死率如表2所列，致死率隨著輻照劑量的增加而提高，當(dāng)劑量為1×1016ion·cm-2時(shí)，致死率達(dá)到99.94%。

表2 ZZU A345輻照致死率Table 2 Radiation lethality of ZZU A345

同列不同小寫(xiě)字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among different mutagenic dose treatments at the 0.05 level; similarly for the following tables.

2.2 突變菌株的篩選

對(duì)ZZU A345進(jìn)行N+注入后，篩選出生長(zhǎng)于MRS-CMC培養(yǎng)基平板上剛果紅染色后透明圈直徑最大且性狀能夠穩(wěn)定傳代的突變菌株345-177。以345-177作為出發(fā)菌株，進(jìn)行了第2輪N+注入。以注入后透明圈直徑與菌落直徑比值大于出發(fā)菌株為正突變，反之為負(fù)突變，第2輪誘變正突變率為42.4%，負(fù)突變率為57.6%。根據(jù)對(duì)透明圈直徑測(cè)量結(jié)果，篩選出對(duì)羧甲基纖維素具有較好降解作用的突變菌株zw1-33、zw2-8、zw2-21、zw2-2和zw3-57。其中zw1-33為經(jīng)過(guò)1×1015ion·cm-2劑量輻照后篩選得到，zw2-8，zw2-21和zw2-23為經(jīng)過(guò)5×1015ion·cm-2劑量輻照后篩選得到，zw3-57為經(jīng)過(guò)1×1016ion·cm-2劑量輻照后篩選得到。

2.3 發(fā)酵苜蓿草粉性能

為評(píng)估突變菌株在苜蓿青貯中的潛在能力，按照通常苜蓿青貯時(shí)設(shè)置的干物質(zhì)含量進(jìn)行苜蓿草粉發(fā)酵試驗(yàn)。在接種0 h后，各組間pH差異不顯著(P>0.05)(表3)。發(fā)酵24 h后，處理組pH顯著低于(P<0.05)對(duì)照組，且添加突變菌株的處理組pH均低于添加出發(fā)菌株ZZU A345的處理組，其中添加突變菌株zw1-33或zw3-57與添加出發(fā)菌株ZZUA345的處理組相比有顯著差異。發(fā)酵48 h后，除添加zw2-23的處理組pH升高外，其余處理組的pH均有所降低，并趨向于同一水平。

表3 菌株發(fā)酵苜蓿草粉不同時(shí)間的pHTable 3 Changes of pH with time in the fermentation test

2.4 菌株的纖維素內(nèi)切酶活性

出發(fā)菌株ZZU A345及誘變后突變菌株的纖維素內(nèi)切酶酶活測(cè)定結(jié)果表明，ZZU A345的酶活性為4.50 μg· (mL·min)-1，345-177為4.65 μg· (mL·min)-1，zw1-33為4.52 μg· (mL·min)-1，zw2-21為5.01 μg· (mL·min)-1，zw3-57為4.94 μg· (mL·min)-1。雖然誘變前后菌株間纖維素內(nèi)切酶酶活沒(méi)有顯著差別(P>0.05)，但突變菌株的酶活均略高于出發(fā)菌株ZZU A345。

2.5 苜蓿青貯65 d的發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值

苜蓿收割后對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，在青貯前苜蓿樣品的干物質(zhì)含量為38.78%,pH 6.15，粗蛋白含量為21.28%。樣品中未檢測(cè)到乳酸、乙酸、丙酸及丁酸成分。

在苜蓿青貯中以不加菌的為對(duì)照組(CK)，分別添加菌株ZZU A345及突變菌株zw2-21的為處理組，青貯65 d，青貯樣品的pH及有機(jī)酸含量如表4所列。添加zw2-21的處理組pH顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且乳酸含量最高。青貯65 d后，各組樣品均未發(fā)生腐敗，未檢測(cè)到丙酸或丁酸。添加突變菌株zw2-21的處理組乳酸含量顯著高于添加出發(fā)菌株ZZU A345的處理組(P<0.05)。各組苜蓿樣品的干物質(zhì)及粗蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。

表4 青貯65 d苜蓿pH及有機(jī)酸含量Table 4 pH and organic acid content after 65 d ensiling

3 討論

乳酸菌添加劑能夠有效提高牧草青貯質(zhì)量[11-13]。然而，苜?？扇苄蕴呛康?，纖維類(lèi)物質(zhì)含量高，致使乳酸菌無(wú)法正常生長(zhǎng)和產(chǎn)生足量乳酸。為提高苜蓿青貯初期的可溶性糖含量，增加其纖維類(lèi)物質(zhì)的降解是一種可能的方式。Siezen等[14]發(fā)現(xiàn)，植物附生的一些天然乳酸菌具有編碼部分植物多糖分解相關(guān)酶的基因簇，這為選育具有內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶等纖維類(lèi)物質(zhì)分解酶酶活性較高的乳酸菌提供了研究基礎(chǔ)。離子注入方法不僅在纖維降解黑曲霉、里氏木霉和解淀粉芽孢桿菌菌種選育中廣泛應(yīng)用[15-18]，也同樣被運(yùn)用于乳酸菌菌種選育。利用離子注入的方法，研究者[19-20]分別在選育共軛亞油酸及L-乳酸高產(chǎn)植物乳桿菌菌株方面均取得了良好效果。本研究應(yīng)用N+注入植物乳桿菌，篩選出降解纖維素及發(fā)酵苜蓿粉產(chǎn)酸能力均有提高的突變菌株zw2-21及zw3-57。

乳酸菌利用纖維素生長(zhǎng)的能力較弱，本研究對(duì)Teather和Wood[9]的纖維素酶活測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，添加少量葡萄糖促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，并以同樣方式對(duì)乳酸菌進(jìn)行預(yù)處理，再使用DNS法測(cè)定其酶活，建立了有效的乳酸菌纖維素酶活測(cè)定方法。

在苜蓿青貯中，添加突變菌株zw2-21的處理組乳酸含量最高。乳酸能夠有效降低青貯飼料的pH，抑制腐敗發(fā)生，同時(shí)能夠改善飼料口感。添加zw2-21的處理組pH在各組青貯樣品中最低，這與其乳酸含量較高的測(cè)定結(jié)果是一致的。乙酸具有一定的抑菌效果，但其刺激性氣味或?qū)δ敛菘诟挟a(chǎn)生影響，進(jìn)而影響牲畜的攝食量。干物質(zhì)含量是反應(yīng)牧草有效營(yíng)養(yǎng)成分的重要指標(biāo)，本研究中，自然青貯未出現(xiàn)霉變腐爛，且添加乳酸菌添加劑與否并未對(duì)青貯樣品的干物質(zhì)及粗蛋白含量產(chǎn)生顯著影響，可能與研究材料自身成分和附著微生物適于青貯有關(guān)。

4 結(jié)論

經(jīng)過(guò)N+注入誘變選育所得突變菌株zw2-21的纖維類(lèi)物質(zhì)分解能力及發(fā)酵苜蓿粉產(chǎn)酸能力均有所提高，且在苜蓿青貯中有效提高了乳酸含量，降低了青貯飼料的pH。因此，應(yīng)用N+注入誘變的方法能夠有效提高乳酸菌對(duì)纖維類(lèi)物質(zhì)的降解能力，得到的突變菌株在苜蓿青貯應(yīng)用中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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