楊渝偉，陳小紅，彭 玲，唐 潔，俸家富

(四川省綿陽市中心醫(yī)院檢驗科 621000)

據(jù)2013年流行病學調(diào)查顯示，中國有乙型肝炎病毒(HBV)感染攜帶者約1億人，其中至少20 000 000為慢性活動性HBV感染患者，包括慢性乙型肝炎(CHB)、乙型肝炎肝硬化(HBC)、CHB相關(guān)肝細胞癌(HCC)[1]。有研究證實，約60%肝硬化患者和80%HCC患者由HBV持續(xù)感染所致，是中國HBC和HCC發(fā)病的主要原因[2]。據(jù)WHO報道，全世界每年約650 000例死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化、HCC[3]。有許多研究表明HBV基因變異與HCC發(fā)病風險密切相關(guān)。但迄今為止，有關(guān)HBC和HCC的發(fā)生、發(fā)展與HBV基因組之間的作用機制尚不十分清楚[4]。目前，HBV基因分型和耐藥突變基因檢測已在中國廣泛用于指導臨床對HBV感染所致肝病的抗病毒藥物治療。但是，HBV耐藥突變基因是否與HBC、HCC發(fā)病風險和疾病發(fā)展(疾病嚴重程度)有關(guān)，至今少有報道。

氧化應激(OxS)是機體抗氧化物質(zhì)消耗和/或氧化物質(zhì)生成過多，引起機體氧化與抗氧化平衡失調(diào)所致的一種疾病。因此，OxS和炎性反應密切相關(guān)。HBV感染不同肝病狀態(tài)下，OxS狀態(tài)與HBV病毒基因型和耐藥突變基因是否存在某種必然的相關(guān)性，也少有研究報道。

現(xiàn)檢測HBV感染不同肝病狀態(tài)下，病毒基因型和耐藥突變率，以及患者血清總氧化態(tài)(TOS)、總抗氧化態(tài)(TAS)、OxS指數(shù)(OSI)水平，分析HBV基因變異與患者OxS之間的相關(guān)性，以了解不同基因型HBV感染后，其耐藥突變率與患者OxS狀態(tài)和病情嚴重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年2月至2016年4月該院經(jīng)乙型肝炎血清學標志物和/或HBV DNA檢測，確診的HBV感染肝病患者296例，男232例，女64例，平均年齡(42.4±13.5)歲。CHB患者145例(CHB組)，HBC患者101例(HBC組)，HCC患者50例(HCC組)。所有病例診斷均符合WHO 2015版CHB、APASL 2012版肝纖維化和/或NCCN 2016版肝膽腫瘤診療指南標準[5]。所有患者在OxS相關(guān)參數(shù)檢測的前1周，均停止使用抗氧化治療藥物，如螺旋藻、維生素E、維生素C、多烯磷脂、肌苷片、輔酶Q10等。

1.2儀器與試劑 血清TOS和TAS檢測試劑由本研究通過方法學改良研制，均在LST008型全自動生化分析儀(日本，HITACHI)上測定；TOS試劑制備的主要化學試劑為二甲酚橙四鈉鹽(CAS：3618-43-7，Cat.No.：398187)和六水硫酸亞鐵銨(CAS：7783-85-9，Cat.No.：215406)，均購自Sigma-Aldrich公司；TAS試劑制備的主要化學試劑為ABTS(CAS：30931-67-0，Cat.No.：11557)，購自Sigma-Fluka公司。HBV基因型及耐藥突變基因試劑盒購自亞能生物技術(shù)有限公司(深圳，中國)，嚴格按照說明書操作程序進行測定；聚合酶鏈式反應(PCR)擴增反應采用ABI7500 Real Time PCR System(AB公司,美國)；雜交反應使用YN-H16型恒溫雜交儀(中國，深圳亞能)。

1.3方法

1.3.1標本采集 用2支不含任何添加劑的Vacutainer真空采血普通管(BD公司，美國)，各抽取患者靜脈血約5 mL，待血塊自然收縮后，以3 000 r/min離心10 min，分離血清。其中1管4 h內(nèi)用于血清TOS和TAS檢測；另1管血清用于HBV基因分型及耐藥突變基因檢測，按試劑盒說明書，未檢測前置―20 ℃冰凍保存。

1.3.2OxS指標測定 血清TOS測定采用改良二甲酚橙法：血清中氧化物質(zhì)可使酸性環(huán)境中的亞鐵離子(Fe2+)氧化成高鐵離子(Fe3+)，后者使二甲酚橙溶液顏色改變，顏色變化強度與血清TOS水平呈正比，以100.0 μmol/L H2O2作為標準，結(jié)果以μmol H2O2Eq./L表示。血清TAS測定采用改良ABTS法[10]：血清中抗氧化物質(zhì)可將藍綠色的激活態(tài)ABTS還原，顏色變化程度與血清TAS水平呈正比，以5 mmol/L水溶性維生素E類似物(Trolox)作標準，結(jié)果以mmol TroloxEq./L表示。OSI根據(jù)兩者檢測結(jié)果按公式計算[6]：

1.3.3HBV基因型及耐藥突變基因檢測 患者血清標本、陽性和陰性質(zhì)控品用病毒DNA提取純化試劑同步處理(離心柱法)后，采用PCR-反向點雜交法檢測3種HBV基因型(B、C、D型)和8種耐藥突變基因(t180L、rt204M、rt207V、rt236N、rt250M、rt181A、rt184T、rt202S)。

2 結(jié) 果

2.1各組患者實驗室檢測結(jié)果比較 各組患者的性別、年齡、OxS參數(shù)和基因檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗分析顯示，患者OxS參數(shù)TOS(Z=1.547，P=0.017)、TAS(Z=1.702，P=0.006)和OSI(Z=2.034，P=0.042)檢測結(jié)果均非正態(tài)分布。本組296例肝病患者感染HBV分為B型213 例(72.0%)和C型83 例(28.0%)；HBV發(fā)生耐藥突變89/296例(30.1%)，其中B基因型占64/296例(21.6%)，C基因型占25/296例(8.5%)。各組患者隨疾病的嚴重度加深(CHB組

表1 各組患者實驗室檢測結(jié)果比較

注：-表示無數(shù)據(jù)

2.2各組患者HBV感染狀況及OxS結(jié)果比較 TAS在CHB、HBC組之間差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.135,P=0.152)，但在CHB、HCC組(Z=2.611,P<0.01)和HBC、HCC組(Z=1.980,P=0.001)之間比較，差異有統(tǒng)計學意義；TOS和OSI，以及HBV基因型分布和耐藥突變率在任意2組患者之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組患者之間的結(jié)果比較(χ2/Z，P)

2.3各組患者HBV耐藥基因突變結(jié)果比較 8種耐藥突變基因在CHB患者中的突變率相近(2.1%～5.5%)；HBC患者以rt207V(13.9%)和rt250M(13.9%)突變率最高；HCC患者以rt204M(36.0%)突變率最高，其次為rt180L(16.0%)。3組患者rt180L、rt204M、rt207V、rt236N、rt250M突變率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，rt181A、rt184T、rt202S突變率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Gamma相關(guān)分析顯示，rt180L、rt184T、rt204M、rt207V突變率與病情嚴重程度相關(guān)，其中rt180L(r=0.494，P=0.009)、rt204M(r=0.790，P<0.01)和rt207V(r=0.373，P=0.047)突變率呈明顯的正相關(guān)，rt184T呈負相關(guān)(r=―1.000，P=0.013)。89例HBV耐藥突變患者中，突變位點數(shù)在1 ～ 7個，將其按0、1、2個或多個(≥3)突變位點進行分組，經(jīng)Gamma相關(guān)分析顯示，突變位點數(shù)與HBV感染后病情嚴重程度呈正相關(guān)(r=0.614，P<0.01)。見表3。

2.4HBV基因分型或耐藥突變各組患者血清OxS結(jié)果比較 C基因型與B基因型HBV感染患者比較，TOS水平在肝病各組，即CHB組(Z=1.691，P=0.007)、HBC組(Z=1.461，P=0.028)、HCC組(Z=1.443，P=0.031)均升高；OSI水平在CHB組(Z=2.019，P=0.001)和HBC組(Z=1.431，P=0.033)升高，但在HCC組差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.155，P=0.139)；TAS水平僅在CHB組降低(Z=1.586，P=0.013)，在HBC組(Z=1.124，P=0.160)和HCC組(Z=0.693，P=0.723)間差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。有突變患者與無突變患者比較，TOS、OSI水平在各組均明顯升高，其中TOS結(jié)果顯示：CHB組(Z=1.605，P=0.012)、HBC組(Z=1.845，P=0.002)、HCC組(Z=2.309，P<0.01)；OSI結(jié)果顯示：CHB組(Z=1.997，P=0.0011)、HBC組(Z=1.711，P=0.006)、HCC組(Z=2.021，P=0.001)；各組TAS水平僅在CHB組降低(Z=1.467，P=0.027)，而在HBC組(Z=1.083，P=0.191)和HCC組(Z=1.212，P=0.106)差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5HBV基因耐藥突變與患者OxS參數(shù)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，各組患者HBV感染后耐藥突變與TOS(r=0.476，P<0.01)和OSI(r=0.441，P<0.01)呈正相關(guān)，與TAS(r=―0.249，P<0.01)呈負相關(guān)(除外HBC組)。見表4。

表3 不同肝病患者HBV感染8個耐藥基因突變率[n(%)]

表4 各組患者血清OxS參數(shù)和耐藥突變發(fā)生與否的相關(guān)性(r，P)

3 討 論

HBV感染是一個世界性公眾健康問題，其感染機體后，HBsAg持續(xù)保存6個月及以上即為CHB[3]。CHB反應促進肝纖維疤痕形成，肝纖維化從門管區(qū)輕度纖維增生到周圍星芒狀纖維條束，橋樣纖維化，直至肝硬化。因此，炎性反應伴隨CHB發(fā)展的一切病理過程。很多研究證實，HBV持續(xù)感染可促進患者的OxS反應，從而引起患者基因改變及表達異常，進一步導致患者氧化/抗氧化平衡破壞，致使疾病惡化向HBC和/或HCC發(fā)展[7]。本研究結(jié)果顯示， CHB、HBC、HCC組患者OxS狀態(tài)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨疾病的嚴重程度加深(通常情況下，按CHB

目前共發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E、F、G、H、I共9種HBV基因型[8]。流行病學調(diào)查顯示中國已發(fā)現(xiàn)A～H共8種基因型，其中以B、C型為主，其次為D型，其極少[9]。本組296例HBV感染患者，僅檢出B、C型2種基因型，未發(fā)現(xiàn)其他類型，可能與選擇的病例多為較嚴重的慢性肝病有關(guān)，但提示四川地區(qū)與我國HBV基因型分布特征基本一致。大量研究表明，B、C型與重癥肝病有關(guān)，且C型較B 型更加嚴重[10]。這也可能是本研究僅檢出B、C型2種基因型的原因。本組研究結(jié)果顯示，按疾病嚴重程度CHB

HBV感染后可通過多種途徑逃逸免疫系統(tǒng)的免疫應答，使之在體內(nèi)長期存在，導致CHB發(fā)生。基因突變是HBV引起免疫逃逸最主要和最根本的原因。本研究296例HBV感染患者，按不同疾病分組后發(fā)生突變的患者，其血清TOS水平均高于未發(fā)生突變患者；TAS水平均低于未發(fā)生突變患者，雖然僅CHB患者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但OSI水平均高于未發(fā)生突變的患者，而且從CHB經(jīng)HBC到HCC發(fā)展過程中，患者的耐藥突變均與血清TOS、OSI水平呈正相關(guān)，與血清TAS水平呈負相關(guān)(HBC患者差異無統(tǒng)計學意義，可能與樣本數(shù)和/或抽樣有關(guān))。研究結(jié)果表明，HBV感染患者氧化物質(zhì)積累和/或抗氧化物質(zhì)消耗，與HBV基因變異密切相關(guān)。推測其原因，可能感染HBV后，因免疫防護激活OxS反應，在其炎性狀態(tài)下，一方面通過氧化損傷引起HBV耐藥基因突變發(fā)生，以逃逸機體免疫應答；另一方面，可增強其對藥物的抵抗，以達到自由復制并長期存在的目的[11]。結(jié)果是進一步加劇患者氧化/抗氧化平衡破壞，加大OxS反應，加重對組織細胞的氧化損傷，進而促進疾病加重，即向HBC和/或HCC發(fā)展[12-14]。

本研究進一步分析，所檢測的8個耐藥基因位點中，rt180L、rt204M、rt207V、rt236N、rt250M突變率在各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且rt180L、rt204M、rt207V位點突變率與病情嚴重程度呈正相關(guān)，其中rt204M的相關(guān)系數(shù)r高達0.790，提示HBV位點突變，特別是rt204M位點突變，是否有可能是HBV感染患者致HBC和/或HCC發(fā)生的潛在因素，值得進一步研究證實。對耐藥突變位點個數(shù)的統(tǒng)計分析表明，HBV感染后其突變位點數(shù)與病情發(fā)展程度呈明顯正相關(guān)(r=0.614，P<0.001)，說明隨CHB向HBC和/或HCC發(fā)展，患者OxS反應逐漸增強，以應答HBV感染所致炎性反應，而HBV為逃逸機體免疫應答，其基因組不穩(wěn)定性更加突出，基因位點隨之發(fā)生多元化突變[15-19]。

綜上所述，OxS反應可能是CHB患者病情發(fā)展及HBV基因在感染者體內(nèi)變異的重要機制。但OxS與HBV基因突變之間的原因和結(jié)果，或者兩者兼而有之，以共同促進HBV感染后肝病的發(fā)生與發(fā)展，因未連續(xù)觀察患者的疾病進程，以致本研究對此問題難以解答，需進一步的實驗研究。

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