丁亮 唐果 薛鋒*肖海軍 何志敏 沈玉春

隨著我國社會老齡人口的增加，椎間盤退變發(fā)病率逐年上升。研究表明軟骨終板退變是椎間盤退變的始動因素，而壓應(yīng)力是導(dǎo)致軟骨終板退變的重要原因。力學(xué)刺激直接影響軟骨終板細胞外基質(zhì)代謝，使得軟骨終板細胞基質(zhì)、離子濃度、pH值、滲透壓以及含水量等發(fā)生改變[1-4]。軟骨細胞外基質(zhì) (extracellular m atrix，ECM)與軟骨細胞功能密切相關(guān)，其合成、降解紊亂是造成軟骨變性的重要原因之一，而基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix m etalloproteinase，MMPs)及其抑制因子 (Tissue inhibitor of metalloproteases，TIMP)可能在這一過程中起重要作用。但目前關(guān)于壓應(yīng)力對軟骨終板MMPs以及 TIMP表達影響的報道不多。本研究通過選擇MMP家族中屬于膠原酶亞型的MMP-1、MMP-3、MMP-13及其抑制因子TIMP-1，觀察壓應(yīng)力作用后其表達變化情況，進一步探討 MMP-1、MMP-3、MMP-13和 TIMP-1與壓應(yīng)力致軟骨終板退變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象及軟骨終板細胞的分離、培養(yǎng)

將6個月意外流產(chǎn)胎兒軟骨終板（已獲南方醫(yī)科大學(xué)附屬奉賢醫(yī)院倫理委員會批準），進行原代細胞培養(yǎng)。無菌條件下取 L4/5軟骨終板，并切取軟骨終板，切至1 mm3大小，用含青霉素鈉/鏈霉素雙抗液的磷酸緩沖鹽溶液 (PBS)液沖洗。以0.25%胰蛋白酶、0.30%膠原酶消化，直到軟骨塊完全消化、分離成軟骨細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及藥品

多聚甲醛、乙二胺四乙酸（EDTA）購于國藥集團公司；新鮮細胞組織總RNA提取試劑盒，購自上海諾倫生物，批號：LN-0108；由上海諾倫生物公司合成 PCR引物；Realtime PCR擴增試劑盒購自上海諾倫生物公司。MMP-1一抗兔多克隆抗體 (美國 abcam 公司，ab52631)；MMP-3一抗兔多克隆抗體 (美國abcam公司，ab52915)；MMP-13一抗兔多克隆抗體 (美國 abcam 公司，ab51072)；TIMP-1一抗兔多克隆抗體 (美國abcam公司，ab81282)；二抗辣根酶標記山羊抗兔IgG(上海晶美生物，進口分裝)。

1.3 周期性壓應(yīng)力加載

將培養(yǎng)的第2代軟骨終板細胞以1×106/mL的密度種于6孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱靜態(tài)培養(yǎng)至達90%匯合。用含1%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，使大部分實驗細胞均處于G0期，達到實驗細胞同步化的目的。目前模擬體外力學(xué)環(huán)境的實驗方法較多[5]，我們是通過特定裝置進行氣體加壓構(gòu)建細胞壓應(yīng)力加載模型：該加載裝置由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院成骨細胞壓應(yīng)力課題組提供（細胞壓力加載實驗系統(tǒng)示意圖及產(chǎn)品外觀圖如下），該裝置采用SANTN溫控裝置控制溫度，德國全進口數(shù)顯壓力表，使系統(tǒng)壓力和溫度監(jiān)控更精確，再施加周期性壓應(yīng)力。工作原理：將體外培養(yǎng)的NCs細胞種植在培養(yǎng)皿上，再將培養(yǎng)皿放入壓力腔中，壓力室密封形成密閉腔體，外界供5%CO2的空氣混合氣，利用氣體產(chǎn)生的靜壓使培養(yǎng)皿內(nèi)細胞受到相應(yīng)的壓應(yīng)力作用。實驗系統(tǒng)具備穩(wěn)定的氣壓源，應(yīng)力設(shè)計范圍為 0 Kpa～ 100 Kpa，施加周期性壓應(yīng)力（壓力大小 0.8 MPa，頻率為0.1 Hz），連續(xù)加載9天。根據(jù)壓應(yīng)變作用時間分為2 h組、6 h組、12 h組，每天除對照組外，各實驗組連續(xù)加載2 h、6 h和12 h，對照組采用相同處理方式，不施加壓應(yīng)力。作用結(jié)束后，立即用PBS沖洗細胞，在倒置顯微鏡下拍照，并收集樣品。

圖1，細胞壓力加載實驗系統(tǒng)示意圖

圖2，細胞壓力加載實驗系統(tǒng)產(chǎn)品外觀

1.4 總RNA的提取

使用TRIzol法提取RNA，并用RNasey Mini Kit純化，測量純化后的RNA濃度以及RNA完整性。

1.5 Real-time PCR分析

按照逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用PCR試劑盒建立反應(yīng)體系，將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀進行擴增。電泳進一步鑒定產(chǎn)物。

GAPDH作為內(nèi)參，用LightCycler SoftwareVersion軟件分析目的基因相對表達量（見表1）。Real-time PCR反應(yīng)條件：95℃，1分鐘變性；95℃，12秒，62℃，40秒，共40個循環(huán)。

1.6 Western blot實驗

培養(yǎng)第3天取各組細胞，每種細胞樣本加入100 LRIPA裂解液，使細胞完全裂解。裂解物移入離心管中。取5L樣本加入5L SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（2×），100℃加熱處理5min，冰上冷卻。離心10min。分離樣品后每孔20 L上樣。甲醇浸泡PVDF膜后繼續(xù)Transfer Buffer浸泡10 min。使用Trans-BlotSDCell進行電泳轉(zhuǎn)移完畢后，用麗春紅染色液染色并標記蛋白質(zhì)Marker的條帶位置。使用Western封閉液封閉轉(zhuǎn)印膜2h，然后用1×TBST洗滌3次，每次10 min。分別加入1∶1000一抗4℃孵育過夜。1×TBST洗滌3次，每次15 min。加入1∶10000二抗，室溫孵育2 h。1×TBST洗滌3次，每次15 min。用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進行化學(xué)發(fā)光檢測，并對 X光片曝光。顯影定影后，拍照并分析。

表1，各目的基因引物序列

1.7 MTT實驗

終板軟骨細胞培養(yǎng)至80%～90%時，施加相應(yīng)時間的壓應(yīng)力后接種96孔板，每組3孔，每日測3孔取平均值，連測9 d。吸出檢測孔培養(yǎng)液，加入MTT 20 L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，每孔使用移液槍加入DMSO 150 L，震蕩10 min，酶聯(lián)檢測儀上以570nm波長測吸光度（A）值。繪制生長曲線。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行實驗數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)分析采用獨立樣本t檢驗、方差分析分別進行兩組間以及多組間比較，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)

貼壁后的正常軟骨終板細胞成短梭形、三角形以及多邊形，呈典型的“鋪路石”狀；而隨著細胞加壓時間延長，出現(xiàn)細胞形態(tài)改變，長梭形細胞明顯增加，細胞去分化現(xiàn)象明顯，老化速度加快，壞死細胞明顯增多（見圖3）。壓力大小0.8 Mpa）。

圖3，壓應(yīng)力下人軟骨終板細胞培養(yǎng)第9天細胞形態(tài)（A對照組2h；B對照組6 h；C對照組12 h；D加壓2 h；E加壓6 h；F加壓12 h；

2.2 MTT法測定細胞增殖率結(jié)果

通過對軟骨終板細胞分別施加0.8Mpa壓應(yīng)力，加壓時間分別為2 h、6 h、12 h，MTT法測定A值繪制的生長曲線顯示，短時間（2 h）壓應(yīng)力作用促進細胞增殖，長時間（6 h、12h）壓應(yīng)力抑制細胞增殖。壓應(yīng)力作用6 h、12h組分別與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖4）。

圖4，壓應(yīng)力(壓力大小0.8 Mpa)下人軟骨終板細胞MTT折線圖

2.3 Real-time PCR和WesternBlot表達結(jié)果

壓應(yīng)力（壓力大小0.8MPa）下人軟骨終板細胞培養(yǎng)第3天 Western Blot、RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn) MMP-1、MMP-3、MMP-13表達在壓應(yīng)力作用2h時下降，TIMP-1表達增加；壓應(yīng)力作用6 h組 MMP-1、MMP-3、MMP-13表達增加，TIMP-1表達下降；壓應(yīng)力作用12 h組 MMP-1、MMP-3、MMP-13表達顯著增加，TIMP-1表達顯著下降。壓應(yīng)力作用12 h組與各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖5-6）。

圖5，壓應(yīng)力（壓力大小0.8 MPa）下人軟骨終板細胞培養(yǎng)第3天RTPCR結(jié)果

圖6，壓應(yīng)力（壓力大小0.8MPa）下人軟骨終板細胞培養(yǎng)第3天Western Blot結(jié)果

3 討論

腰椎間盤退變是骨科常見的慢性病之一，由其引起的一系列癥狀可嚴重影響患者的生活質(zhì)量，甚至造成肢體殘疾，喪失勞動能力，耗費大量的醫(yī)療費用，給患者和社會帶來了沉重的負擔。隨著我國老齡化社會的到來，椎間盤退變發(fā)病率逐年上升，文獻報道超過80%的人在其一生中將經(jīng)歷下背部疼痛，同時在60歲以上人群中高達90%的人存在至少一個節(jié)段的椎間盤退變[6]。腰椎間盤退變是一種多因素疾病，其具體機制尚不十分明確，研究發(fā)現(xiàn)與腰椎異常應(yīng)力、遺傳、增齡、勞動、吸煙等多種生活習慣等有關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)軟骨終板與椎間盤關(guān)系密切，軟骨終板退變是引起椎間盤營養(yǎng)障礙和退變的始動因素[9,11]。軟骨終板為一扁圓盤狀半透明結(jié)構(gòu)，它與纖維環(huán)一起包繞髓核，起到緩沖外力和傳遞應(yīng)力的作用。椎間盤本身是無血供組織，其營養(yǎng)物質(zhì)的獲得和代謝產(chǎn)物的排出通過骨髓腔-血竇-軟骨終板界面的擴散作用完成[8]。因此CEP既有屏障功能，又有營養(yǎng)中介作用，椎間盤的退變往往繼發(fā)于軟骨終板的退變，一些研究通過損傷動物軟骨終板從而制備動物椎間盤退變模型[10]。

軟骨終板在日常生活中由于不同姿勢，使其受到力學(xué)刺激方式較復(fù)雜，通常是壓縮、彎曲和扭轉(zhuǎn)的組合，其中以壓縮應(yīng)力最為明顯。力學(xué)刺激直接影響軟骨終板細胞外基質(zhì)代謝，使得軟骨終板細胞基質(zhì)、離子濃度、pH值、滲透壓以及含水量等發(fā)生改變[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)生理范圍內(nèi)的壓應(yīng)力可以促進軟骨終板細胞外基質(zhì)蛋白合成和蛋白多糖分泌，超過生理承受范圍的壓應(yīng)力能抑制蛋白多糖的合成，并增加降解酶的合成[4,12]。本研究在壓應(yīng)力下進行人軟骨終板細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：貼壁后的正常軟骨終板細胞外形呈現(xiàn)短梭形、三角形以及多邊形，出現(xiàn)典型的“鋪路石”狀：而隨著細胞加壓時間延長，出現(xiàn)細胞形態(tài)改變，長梭形細胞明顯增加，細胞去分化現(xiàn)象明顯，老化速度加快，壞死細胞明顯增多。同時通過對軟骨終板細胞分別施加周期性壓應(yīng)力以及不同加壓時間，其 MTT結(jié)果顯示：短時間壓應(yīng)力作用促進細胞增殖，長時間壓應(yīng)力抑制細胞增殖。這提示長時間壓應(yīng)力可以加速軟骨終板細胞老化并抑制細胞增殖從而導(dǎo)致退變。

MMPs是存在于細胞外基質(zhì)中最主要的酶系統(tǒng)，可以降解各種細胞外基質(zhì)蛋白[12-14]。MMP-1、MMP-13屬于MMPs中的膠原酶亞家族，可直接降解軟骨基質(zhì)中最具特征、含量最多的Ⅱ型膠原。MMP-3是與基質(zhì)代謝過程密切相關(guān)的酶，它可促進纖溶酶介導(dǎo)的蛋白酶水解，并參與間質(zhì)膠原酶的激活來降解Ⅱ型膠原。朱新輝等[15]通過測定膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者血液和滑液MMP-3水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎患者與對照者相比，MMP-3水平明顯升高，且表達水平與病變嚴重程度呈明顯正相關(guān)；這提示MMP-3在軟骨退變的病理過程中起重要作用，可以作為軟骨退變、骨性關(guān)節(jié)炎嚴重程度的生物標記。TIMP是MMPs的特異性抑制因子，能調(diào)節(jié)MMPs的活性。細胞外基質(zhì)中過量MMPs的表達可引起聚集蛋白聚糖 (aggrecan)降解，蛋白多糖含量下降，組成成分（硫酸軟骨素/硫酸角質(zhì)素比值下降）和膠原類型發(fā)生明顯改變，可導(dǎo)致軟骨終板生物力學(xué)功能的減退甚至喪失，從而出現(xiàn)退變[12-14]。在本研究中，我們對軟骨終板細胞施加周期性壓應(yīng)力，并通過 Western-Blot、RT-PCR檢測壓應(yīng)力下人軟骨終板細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13表達情況，結(jié)果顯示：長時間壓應(yīng)力加載使 MMP-1、MMP-3、MMP-13表達顯著增加，其表達情況與壓應(yīng)力作用時間呈正相關(guān)。

Vo等[16]回顧研究：在人類和動物模型中MMPs基因片段的表達和活性調(diào)控，發(fā)現(xiàn) MMP-1、MMP-13表達及酶活性的上調(diào)與軟骨終板基質(zhì)破壞明顯相關(guān)。在 MMPs所有的亞型中，MMP-1、MMP-13屬于膠原酶亞族，對基質(zhì)代謝影響最為顯著，直接參與 II型膠原的變性裂解，破壞軟骨結(jié)構(gòu)的完整性，對軟骨進行重塑，進而影響軟骨終板退變[15,16]，這些結(jié)論解釋了MMP家族與軟骨終板退變的關(guān)系。同時，還有多項研究證實退變軟骨細胞中 MMP-1、MMP-3、MMP-13可出現(xiàn)顯著升高[17-20]。在本研究中，我們通過對軟骨終板細胞施加周期性壓應(yīng)力，成功驗證壓應(yīng)力可促使部分MMP表達顯著增加，且表達情況與作用時間成正相關(guān)，這提示我們：壓應(yīng)力可通過調(diào)控MMP表達上調(diào)可導(dǎo)致軟骨終板發(fā)生退變。至于“壓應(yīng)作用”通過何種途徑對MMP進行調(diào)控，其機制尚未明確。

綜上所述，MMP-1、MMP-3、MMP-13及TIMP-1在壓應(yīng)力導(dǎo)致軟骨終板退變的發(fā)病過程中起重要作用，MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達與壓應(yīng)力致軟骨終板退變程度相關(guān)，但有關(guān)調(diào)控軟骨終板細胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體生化過程仍有待進一步研究。

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