王 躍，江勁波,聶 甜,付 玲,胡 輝，陳新宇

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

免疫性血小板減少癥(ITP)是臨床常見的獲得性自身免疫性出血疾病，主要表現(xiàn)為血小板計(jì)數(shù)減少，并伴有皮膚黏膜出血、內(nèi)臟出血、女性患者月經(jīng)過多等，對患者生命質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。目前，臨床常用于治療ITP的西醫(yī)類藥物包括單克隆抗體、激素、免疫抑制劑、血小板生成刺激素等，但存在價格昂貴、不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)[1]。而中醫(yī)辨證治療ITP有一定優(yōu)勢，不但能夠有效改善臨床癥狀，且具有不良反應(yīng)少、療效穩(wěn)定的特點(diǎn)，近年來日益受到重視[2]。犀角地黃湯出自《備急千金要方》，具有清心涼血、清熱止血、增強(qiáng)免疫功能的功效[3]，在臨床上得到廣泛應(yīng)用。本研究觀察了犀角地黃湯對ITP模型大鼠外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及Th17細(xì)胞的影響，旨在探討犀角地黃湯治療ITP的可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠50只，SPF級，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購自河南省動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號：SCXK(豫) 2013-0001，所有大鼠購回后均在清潔級動物飼養(yǎng)室IVC籠子中進(jìn)行3 d適應(yīng)性喂養(yǎng)，期間自由飲水?dāng)z食，室內(nèi)溫度20～25 ℃，濕度50%～60%。新西蘭兔5只，購自南昌龍平兔業(yè)有限公司，許可證號：SCXK(贛)2013-001。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 犀角地黃湯中的犀牛角用水牛角代替，水牛角45 g、丹皮9 g、生地黃30 g、白芍12 g。藥材購自同仁堂大藥店，所用藥物先浸泡在冷水中30 min，其中水牛角需先煎煮30 min，再將其他幾種藥材放入，繼續(xù)煎煮60 min，制成1 g/mL的濃縮水煎劑，放置于冰箱中。醋酸潑尼松片購自浙江仙居制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H33021207，規(guī)格：5 mg/片。

1.3兔抗大鼠血小板血清制備 參照文獻(xiàn)[4]中方法，采用戊巴比妥鈉對SD大鼠進(jìn)行麻醉，取大鼠腹主動脈血，放入EDTA抗凝管中，800 g離心15 min分離血漿，再將上清3 000 r/min 離心10 min沉淀血小板，用PBS緩沖液洗滌血小板3次后調(diào)整其濃度為1×109L-1，與等體積的完全弗氏佐劑充分混合制成佐劑抗原，并在新西蘭兔的背部、后肢足墊處進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，首次注射后于1，2，4周分別重復(fù)上述步驟，進(jìn)行多次加強(qiáng)免疫，末次注射后3 d取新西蘭兔的心臟血，37 ℃孵育箱中放置15 min，2 500 r/min離心10 min獲取富含兔抗大鼠的血小板血清(APS)，存放于-80 ℃冰箱中。

1.4動物分組、造模及干預(yù) 將48只SD大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，潑尼松組，犀角地黃湯低、中、高劑量組，每組8只。除正常組外，其余組均進(jìn)行造模：于實(shí)驗(yàn)第1，2，3天連續(xù)以1∶4稀釋的APS(0.7 mL/200 g)進(jìn)行腹腔注射，此后間隔1 d注射1次，共注射11次。APS每次從-80 ℃取出后需流水融化，56 ℃水浴30 min以滅活補(bǔ)體。正常組大鼠在同一時間點(diǎn)腹腔注射相同體積的生理鹽水(0.7 mL/200 g)。于造模開始后第7天，正常組和模型組每天灌胃蒸餾水；醋酸潑尼松組每天灌胃醋酸潑尼松混懸液(先將片劑研磨碎后采用蒸餾水配制成混懸液，每次給藥前充分混勻)5.4 mg/kg；犀角地黃湯各劑量組每天灌胃犀角地黃湯，給藥劑量參照文獻(xiàn)[4]按照體表面積公式與人的等效劑量進(jìn)行換算(200 g大鼠的劑量=70 kg人的給藥劑量×0.018)，低、中、高劑量組給藥劑量為0.012 5 g/kg、0.025 g/kg、0.05 g/kg，待給藥時分別采用無菌蒸餾水稀釋為1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL。各組灌胃劑量均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)14 d。

1.5觀察指標(biāo) ①大鼠一般情況：觀察實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠精神、活動狀態(tài)及毛發(fā)、飲食等情況。②外周血血小板檢測：分別于造模前、灌胃前、灌胃結(jié)束后尾靜脈取血0.5 mL，采用日本東亞Sysmex公司生產(chǎn)的XT-1800i型全自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測血小板計(jì)數(shù)。③Th17、Treg細(xì)胞檢測：末次灌胃后采用10%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔麻醉大鼠，采集腹主動脈血，加入EDTA抗凝管中，采用Ficoll分層法分離血中單核細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1，加入PMA、離子霉素、莫能霉素工作液(美國Biochemicals公司)吹打混勻后37 ℃孵育4 h，加入FITC標(biāo)記的CD4抗體(美國BD Bioscience公司)，于4 ℃避光放置，孵育30 min，采用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min后，加入膜裂解劑室溫孵育15 min，加入FITC標(biāo)記的IL-17A(美國BD Bioscience公司)和PE標(biāo)記的Foxp3(美國BD Bioscience公司)，于4 ℃繼續(xù)避光孵育30 min，采用美國Beckman公司生產(chǎn)的CytomicsTM FC500流式細(xì)胞儀對細(xì)胞信號進(jìn)行采集，并通過配套軟件CXP 2.2計(jì)算Th17/Treg的比率。④外周血單個核細(xì)胞中Foxp3mRNA測定：取大鼠末次灌胃后腹主動脈抗凝血1 mL與生理鹽水1 mL及淋巴細(xì)胞分離液2 mL混合后400 g離心20 min,取第2層細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞，采用Trizol法提取淋巴細(xì)胞中的總RNA，采用Reverse Transcription Kit(日本Takara公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(日本TaKaRa公司)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析，反應(yīng)體系：2×SYBRR Premix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL，采用7500系統(tǒng)(美國ABI公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個循環(huán)，以β-action作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算Foxp3mRNA相對表達(dá)量。引物序列：Foxp3正向?yàn)?’-CTCGCCCAGATATACGAATGG-3’，反向?yàn)?’-GCCGAGCTGTTGCTGTCA-3’；β-action正向?yàn)?’-GTCAGGTCATCACTATCGGCA-3’，反向?yàn)?’-AGAGGTCTTTACGGATGTCAA-3’。⑤血清中IL-17、IL-35水平測定：取大鼠末次灌胃后腹主動脈血3 mL，800 g離心10 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測血清IL-17、IL-35水平，檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，全波長Multiskan FC型酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific公司，所有操作均按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀況 正常組大鼠飲食、活動、呼吸均正常，精神狀態(tài)良好；其他組大鼠在連續(xù)3 d造模后活動力明顯下降，呼吸加快，皮毛欠光澤，食欲下降，各給藥組大鼠給藥后整體狀況均較模型組明顯改善。

2.2各組大鼠血小板數(shù)目比較 造模前，各組大鼠血小板計(jì)數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；灌胃前，各造模組大鼠血小板計(jì)數(shù)均明顯低于正常組(P均<0.05)；灌胃結(jié)束后，各給藥組大鼠血小板計(jì)數(shù)均明顯低于正常組但明顯高于模型組(P均<0.05)，但犀角地黃湯低、中劑量組明顯低于犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組(P均<0.05)，犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3各組大鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞所占比例比較 模型組大鼠外周血中Th17細(xì)胞所占比例和Th17/Treg細(xì)胞比率明顯高于正常組(P均<0.05)，Treg細(xì)胞所占比例明顯低于正常組(P<0.05)；各給藥組外周血中Th17細(xì)胞所占比例和Th17/Treg細(xì)胞比率均明顯低于模型組(P均<0.05)，Treg細(xì)胞所占比例明顯高于模型組(P均<0.05)；犀角地黃湯低、中劑量組外周血中Th17細(xì)胞所占比例和Th17/Treg細(xì)胞比率均明顯高于犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組(P均<0.05)，Treg細(xì)胞所占比例明顯低于犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組(P均<0.05)，犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2及圖1。

表1 各組大鼠血小板數(shù)目比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與醋酸潑尼松組比較，P<0.05。

2.4各組大鼠外周血單個核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較 正常組、模型組、醋酸潑尼松組及犀角地黃湯低、中、高劑量組大鼠外周血單個核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平分別為0.85±0.05，0.23±0.01，0.58±0.03，0.50±0.02，0.56±0.02，0.69±0.03，模型組Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常組(P<0.05)，各給藥組Foxp3 mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，但犀角地黃湯低、中劑量組明顯低于犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組(P均<0.05)，犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與醋酸潑尼松組比較，P<0.05。

圖1 各組大鼠Th17/Treg細(xì)胞流式圖

2.5各組大鼠血清IL-17、IL-35水平比較 模型組大鼠血清IL-17水平明顯高于正常組(P<0.05)，IL-35水平明顯低于正常組(P<0.05)；各給藥組大鼠血清IL-17水平明顯低于模型組(P均<0.05)，IL-35水平明顯高于模型組(P均<0.05)；犀角地黃湯低、中劑量組血清IL-17水平均明顯高于犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組(P均<0.05)，IL-35水平明顯低于犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組(P均<0.05)，犀角地黃湯高劑量組和醋酸潑尼松組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

3 討 論

ITP約占出血性疾病的1/3，在各個年齡段均可發(fā)病，其中兒童的發(fā)病率相對較高[5]。近年來研究表明，T淋巴細(xì)胞亞群比例異常、功能紊亂及相關(guān)細(xì)胞因子分泌異常在ITP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但其具體致病機(jī)制并未闡明[6]。Treg細(xì)胞的表型為CD4+CD25+，是具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞；Foxp3是在Treg細(xì)胞核中特異性表達(dá)的細(xì)胞因子，主要發(fā)揮免疫抑制活性，其在多種免疫系統(tǒng)疾病中存在表達(dá)降低的現(xiàn)象；IL-35是目前發(fā)現(xiàn)的由Treg細(xì)胞分泌的唯一一個細(xì)胞因子，能夠上調(diào)IFN-γ的表達(dá)，限制機(jī)體過度免疫應(yīng)答[7-8]。Th17細(xì)胞是除Th1、Th2外的第三類效應(yīng)T細(xì)胞，能夠高水平分泌IL-17，活化NF-κB相關(guān)通路，激活下游因子，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)等多種炎性疾病中發(fā)揮重要作用[9]。相關(guān)研究表明Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例失衡與哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種疾病的發(fā)生具有密切關(guān)聯(lián)[10-11]，但目前國內(nèi)有關(guān)其與ITP相關(guān)性研究較少。本研究觀察到，模型組大鼠淋巴細(xì)胞中Treg細(xì)胞所占比例明顯下降，Th17細(xì)胞所占比例和Th17/Treg比率明顯升高， Foxp3 mRNA表達(dá)顯著降低，且相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-35水平均出現(xiàn)分泌異常，與高勇等[12]研究結(jié)果一致，證實(shí)Th17/Treg比例失衡可能是ITP的致病機(jī)制之一，調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡可作為ITP治療的新靶點(diǎn)。

表3 各組大鼠血清細(xì)胞因子IL-17、IL-35水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與醋酸潑尼松組比較，P<0.05。

目前西醫(yī)采用的醋酸潑尼松片能夠減少抗血小板抗體的分泌，減輕對血小板的破壞；單抗CD20能夠清除產(chǎn)抗血小板抗體的B淋巴細(xì)胞；免疫抑制劑能夠抵抗T細(xì)胞對血小板的破壞；但以上藥物治療均無法從根本上逆轉(zhuǎn)免疫系統(tǒng)紊亂，病情易出現(xiàn)反復(fù)，目前尚無理想防治藥物[5，13]。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為ITP屬“紫斑”“血證”“衄血”等范疇，病機(jī)為陰虛火旺、血熱妄行、氣不攝血等[14]，其中血熱妄行是主要病機(jī)，治宜清熱解毒、涼血止血。犀角地黃湯方中犀角清心解毒止血；地黃滋陰生津，可輔助犀角涼血止血；芍藥、丹皮清熱涼血、活血散瘀。既往臨床研究報道顯示，犀角地黃湯用于治療小兒過敏性紫癜[15]、銀屑病[16]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[17]等中醫(yī)辨證為血熱患者具有良好療效。本研究結(jié)果顯示，犀角地黃湯各組大鼠血小板數(shù)目較模型組明顯升高，大鼠整體活力、毛皮光澤及攝食狀況均好于模型組，且外周血淋巴細(xì)胞中Treg所占比例、Foxp3 mRNA相對表達(dá)量及IL-35水平均明顯上升，而Th17細(xì)胞所占比例及IL-17水平均明顯下降，并具有劑量依賴性。提示犀角地黃湯對ITP具有一定治療作用，改善淋巴細(xì)胞中Th17/Treg的比例失衡可能是其作用靶點(diǎn)之一。

綜上所述，犀角地黃湯可能通過上調(diào)ITP大鼠外周血中Treg細(xì)胞表達(dá)，下調(diào)Th17細(xì)胞表達(dá)，維持Treg/Th17平衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-35的表達(dá)而減少血小板過度破壞，但其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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