吳維，江娟，呂磊，梁嘉前，孫瑩，袁敬東，章傳華，周高峰

（湖北省武漢市第一醫(yī)院 泌尿外科，湖北 武漢 430022）

近年來我國男性前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，且我國大多數(shù)前列腺癌患者在初診時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)[1-3]。外泌體（Exosomes）是細(xì)胞通過胞內(nèi)體內(nèi)陷形成多泡體再與細(xì)胞膜融合釋放，該種細(xì)胞脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑大約40～100 nm[4]。外泌體攜帶母體細(xì)胞特征性生物信息分子（如脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，DNA，mRNA，miRNA），并可作為細(xì)胞間運(yùn)輸載體將該生物分子傳遞給其他細(xì)胞[5-6]，參與多種生物學(xué)行為。研究證實(shí)，外泌體不僅存在于體外培養(yǎng)的細(xì)胞上清中，且大量存在于機(jī)體的血液、尿液和唾液等體液和疾病狀態(tài)下的胸水、腹水之中[7-9]。其中，外周血中的外泌體與多種疾病如心血管疾病和惡性腫瘤密切相關(guān)，并可作為這些疾病診斷的重要潛在標(biāo)志物[10-12]。本研究的目的是比較正常人和前列腺患者外周血外泌體的含量，并探究外泌體在前列腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月1日-2016年12月31日于武漢市第一醫(yī)院泌尿外科就診的前列腺癌患者16例。手術(shù)切除16例前列腺癌標(biāo)本及相應(yīng)瘤旁組織，所有標(biāo)本均由2位病理醫(yī)師獨(dú)立診斷，并結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及組織學(xué)特點(diǎn)確診?；颊吣挲g54～72歲，中位年齡61.81歲。所有患者均無飲酒愛好，多數(shù)患者無吸煙愛好。標(biāo)本獲取前均告知患者并簽署知情同意書，研究方案經(jīng)武漢市第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 外泌體檢測

1.2.1 材料和設(shè)備 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）及雙抗（青霉素+鏈霉素）、胰蛋白酶（購自美國Hyclone公司），MTT、DAPI封片劑（購自武漢谷歌生物科技有限公司），Ki-67、CD63、CD9、GAPDH一抗（購自美國Sigma公司），細(xì)胞培養(yǎng)耗材（購自無錫耐思生物科技有限公司）。

1.2.2 外泌體的分離與純化 用含抗凝劑的真空采血管收集前列腺癌者5 ml靜脈血樣品；并轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃條件下，1 000 r/min離心20 min，取上清液，加入上清體積3倍的無菌PBS稀釋血清；4℃條件下4 600 r/min離心20 min；取上清液，并將上清液以0.2 μm濾器過濾，最后4℃條件下34 000 r/min離心70 min，得到沉淀，并以150 μl無菌PBS重懸沉淀，即獲得外泌體。以BCA法測定外泌體蛋白濃度，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。收集?xì)胞培養(yǎng)上清，以上述離心方法收集細(xì)胞上清中外泌體。

1.2.3 外泌體形態(tài)表征 取10 μl外泌體PBS垂懸液滴于碳支持膜銅網(wǎng)上，室溫孵育5 min，濾紙吸干銅網(wǎng)；將銅網(wǎng)置于1%磷鎢酸復(fù)染液中染色，3 min后濾紙吸干液體，自然晾干銅網(wǎng)；將銅網(wǎng)置于Hitachi HT7700型透射電鏡上觀察、拍照，測量外泌體粒徑大小。將PBS重懸的外泌體樣品吸附至鎳網(wǎng)上，自然風(fēng)干；2.5%的戊二醛固定10 min，PBS漂洗3次；加入CD63抗體20 ml（1∶100）或CD9抗體20 ml（1∶100）于37℃孵育2 h，PBS漂洗3次，加入金標(biāo)二抗20 ml（1∶100）于37℃孵育1 h，PBS漂洗3次；醋酸鈾負(fù)染5 min，以濾紙吸干染液；待樣品干燥后置于透射電鏡下觀察。

1.2.4 Western blot 收集蛋白，并用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。按所測蛋白濃度計(jì)算樣品（蛋白上樣量為20 μg）和上樣緩沖液體積后，將其混合并置于95℃水浴鍋中水浴5 min。配制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），80 V恒壓下蛋白電泳至分離膠與濃縮膠界面時(shí)換為120 V電壓，然后200 mA，2 h恒流下將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。封閉2 h后，分別以 CD63（1∶ 1 000）、CD9（1∶ 1 000）、Cyclin D1（1 ∶ 1 000）、phospho-Rb（pRb，1 ∶ 1 000）、GAPDH（1∶10 000）抗體4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。化學(xué)發(fā)光劑顯色后，蛋白凝膠成像系統(tǒng)分析樣品中目標(biāo)蛋白的相對含量。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) 前列腺細(xì)胞系LNCap細(xì)胞來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）。LNCap細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，隔天換液，每3天傳代1次；細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃、約95%濕度、5%二氧化碳CO2濃度。

1.2.6 MTT實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度加入96孔板：每孔加入100 μl，使細(xì)胞調(diào)密度1 000～10 000/孔。細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入終濃度為5、10和15 μg/ml前列腺癌患者來源的外泌體。5% CO2，37℃孵育0～72 h，每孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值，并與對照組0 h的吸光度值比較。

1.2.7 細(xì)胞活力檢測 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度加入12孔板：每孔加入2 ml，使細(xì)胞調(diào)密度5×105/孔。細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入終濃度為15 μg/ml前列腺癌患者來源的外泌體。5% CO2，37℃孵育24 h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，消化細(xì)胞，細(xì)胞活力儀器檢測細(xì)胞活力。

1.2.8 免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本取材后切成小塊組織，4%多聚甲醛固定標(biāo)本、流水沖洗后，梯度酒精脫水、石蠟包埋及組織切片（4 μm）。然后二甲苯脫蠟、梯度酒精入水、高壓抗原修復(fù)、羊血清37℃孵育切片20 min，甩去血清，滴加CD63一抗（1∶200），4℃孵育過夜。滴加相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗約50 μl完全覆蓋切片，37℃孵育切片20 min。PBS緩沖液漂洗后，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，37℃孵育切片20 min。PBS緩沖液漂洗后，于光學(xué)顯微鏡下顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后流水沖洗15 min后，梯度酒精脫水，切片晾干后行二甲苯透明及中性樹膠封片過夜。光學(xué)顯微鏡隨機(jī)拍攝5個(gè)高倍視野（×200）/張切片，利用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)CD63著色強(qiáng)度。染色評分由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片完成，取其平均值。

1.2.9 外泌體對前列腺癌肺轉(zhuǎn)移模鼠的影響 將對數(shù)生長期的LNCap細(xì)胞以PBS重懸，使細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml。將200 μl含有細(xì)胞的PBS懸液經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)（每組各10只）。實(shí)驗(yàn)組老鼠，每3天經(jīng)尾靜脈注射1次外泌體（50 μg/次），連續(xù)注射3次。觀察期結(jié)束后，安樂死動物，收獲肺組織切片脫蠟、梯度酒精入水后，滴加適量ki-67（鼠源）和CD-63（兔源）一抗，37℃孵育1 h；PBS洗去抗體；滴加適量對應(yīng)二抗，37℃避光孵育30 min，PBS洗去抗體；以含DAPI封片劑封片；最后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 6.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)，3組及3組以上采用單因素方差分析（One-way-ANOVA）及重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的分離和鑒定

按圖1A所示的程序，離心法收集前列腺患者外周血中的外泌體。將離心所得沉淀以PBS垂懸后，置于透射電鏡下觀察：分離所得的沉淀呈雙層膜結(jié)構(gòu)，大小范圍為20～100 nm，其中30～60 nm的雙層膜結(jié)構(gòu)最多（見圖1B）。Western blot結(jié)果提示，離心分離的沉淀中高表達(dá)CD63和CD9（見圖1C）。免疫電鏡結(jié)果進(jìn)一步提示，CD63、CD9表達(dá)的位置位于雙側(cè)膜結(jié)構(gòu)外膜（見圖1D）。上述鑒定結(jié)果顯示分離所得的沉淀的粒徑分布范圍和表面標(biāo)志分子的表達(dá)均與報(bào)道的文獻(xiàn)結(jié)果一致[13]，證明本研究分離所得的沉淀為外泌體。

2.2 前列腺癌患者外周血外泌體水平

分別收集正常人和前列腺癌患者外周血外泌體，以BCA法測定外泌體總蛋白含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者外泌體含量為（27.69±11.66）μg/ml，高于正常人外周血中外泌體含量（7.41±5.2）μg/ml（見圖2A），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.313，P=0.000）。16例前列腺癌患者分為無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（n=6）和伴發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（n=10）兩組，并進(jìn)一步分析兩組患者外周血外泌體含量。見圖2B所示，伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者外周血中外泌體含量（33.40±10.45）μg/ml＜無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前列腺癌患者外周血中外泌體含量（18.17±5.96）μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.055，P=0.0086）。以上結(jié)果提示外泌體可能在前列腺癌的進(jìn)展中起重要作用。同時(shí)，前列腺癌中CD63組織學(xué)評分（2.04±0.61）高于癌旁正常前列腺組織組織學(xué)評分（0.55±0.21），差異有統(tǒng)計(jì)意義（t=3.870，P=0.000）。見圖2C、2D。

2.3 前列腺癌患者外泌體對前列腺癌細(xì)胞增殖和外泌體分泌的影響

為進(jìn)一步研究外泌體在前列腺發(fā)展中的作用，評估外泌體對前列腺癌細(xì)胞活力和增殖能力的影響。實(shí)驗(yàn)組和對照組數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：不同濃度外泌體處理24 h后細(xì)胞活力無差異（F=0.360，P=0.836）（見圖3A），不同濃度的外泌體對細(xì)胞活力無影響。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同濃度處理后的細(xì)胞增殖活性有差異（F=0.650，P=0.018）。實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞增殖活性有差異（F=0.845，P=0.025），外泌體濃度越高，細(xì)胞增殖活性越高。實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞增殖活性變化趨勢有差異（F=0.576，P=0.015），見圖 2B。

圖1 前列腺癌患者外周血外泌體的分離和鑒定

圖2 前列腺癌患者外周血外泌體含量

Western blot實(shí)驗(yàn)顯示 Cyclin D1（F=0.725，P=0.027）和 pRb（F=0.618，P=0.015）高于對照組細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞增殖活性有差異（F=0.320，P=0.014），外泌體濃度越高，Cyclin D1和pRb表達(dá)水平越高。實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞增殖活性變化趨勢有差異（F=0.576，P=0.015），見圖3B、3C。收集外泌體處理組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并分離上清中外泌體。BCA測定外泌體總蛋白后發(fā)現(xiàn)，外泌體處理組細(xì)胞外泌體分泌量大于對照組細(xì)胞外泌體產(chǎn)量（F=0.451，P=0.027）（見圖3D），且促進(jìn)作用具有濃度依賴性。

2.4 外泌體對前列腺癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠的影響

注射外泌體組裸鼠肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目（16.28±6.94）多于對照組（4.72±2.51）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.265，P=0.000）（見圖4A、B）。肺組織切片H&E染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，單位面積內(nèi)肺轉(zhuǎn)移灶面積大于對照組（見圖4C）。外泌體處理組裸鼠存活時(shí)間較對照組組裸鼠存活時(shí)間短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖4D）（χ2=6.606，P=0.000）。肺轉(zhuǎn)移灶免疫熒光分析結(jié)果顯示，外泌體處理組轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本中CD63和Ki-67表達(dá)水平高于對照組（見圖5A、B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.238，P=0.0067）。

圖3 前列腺癌患者外泌體對前列腺癌細(xì)胞增殖和外泌體分泌的影響

圖4 前列腺癌患者外泌體對前列腺癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠的影響

圖5 肺轉(zhuǎn)移灶中CD63和Ki-67的表達(dá)

圖6 外泌體在前列腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用

3 討論

盡管外泌體最初在1983年就被發(fā)現(xiàn)，但人們一直認(rèn)為它只是一種細(xì)胞的廢棄物[14]。然而最近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其他細(xì)胞的功能。該發(fā)現(xiàn)點(diǎn)燃了人們對細(xì)胞分泌膜泡的興趣。最近的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。近期有學(xué)者報(bào)道，乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體可在肺部或肝部形成利于乳腺癌細(xì)胞生成的微環(huán)境，為迎接癌細(xì)胞向上述器官轉(zhuǎn)移鋪平道路[15]。說明外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中起前鋒作用。我國大多數(shù)前列腺癌患者在初診時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見于骨轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移。前列腺癌細(xì)胞來源的外泌體在前列腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中是否起作用作用目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，前列腺癌患者外周血外泌體濃度高于正常人。此外，伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者外周血中外泌體的含量對于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前列腺癌患者。提示外泌體可能在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。并且前列腺癌患者外周血外泌體可以提高前列腺癌細(xì)胞的增殖活性。隨后在肺轉(zhuǎn)移模型中發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者來源的外泌體在裸鼠體內(nèi)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。該結(jié)果可解釋伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺患者外周血中外泌體的含量高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者。同時(shí)，上述結(jié)果還顯示，外泌體可促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展，并加速前列腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，還發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者來源的外泌體還可以提高前列腺癌細(xì)胞分泌外泌體的能力，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞分泌更多的外泌體。筆者推測，外泌體分泌的增加，導(dǎo)致患者外周血中外泌體含量的進(jìn)步一提高，從而進(jìn)一步促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并誘使細(xì)胞分泌更多的外泌體，形成1個(gè)正反饋環(huán)（見圖6），最終導(dǎo)致前列腺癌發(fā)展加速和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的形成。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)：①前列腺癌患者外周血外泌體含量高于正常人；②伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者外泌體含量高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前列腺患者；③外泌體促進(jìn)前列腺細(xì)胞增殖和外泌體分泌；④外泌體促進(jìn)前列腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究的結(jié)果有助于理解前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移的機(jī)制，以期尋找更好的治療方法。

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