王洪江，楊宏志，張春芝，孫天宇，王英琪

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319）

0 引言

黃酮作為一種人體體內(nèi)需要的營養(yǎng)成分，在體內(nèi)無法自主合成，只能從日常生活的飲食當(dāng)中攝入[1]。沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）是一種落葉性灌木，果實中含有較高VC，沙棘的葉中含有較高的黃酮類化合物[2]。黃酮類化合物的常用的提取方法主要有3種，分別為溶劑法、酶法和超聲波輔助[3-5]，但是通過以上3種方法提取的黃酮化合物需要進(jìn)一步的分離，才能制取我們需要的黃酮化合無單體。黃酮類化合物是一種合成的天然的活性物質(zhì)和極性分子。大孔吸附樹脂是一種物理和化學(xué)性較穩(wěn)定的有機(jī)高分子化合物[6]，極適合分離純化黃酮類物質(zhì)。因此，試驗利用大孔吸附樹脂對超聲輔助提取的沙棘葉總黃酮進(jìn)行分離，研究了大孔吸附樹脂的篩選、吸附和洗脫的工藝條件。

1 試驗材料

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購自成都邦成生物工程公司；D101樹脂、XAD-7PH樹脂、D3520樹脂、NKA-9樹脂，均購自蚌埠市天星樹脂有限公司；X-5樹脂、D4020樹脂，均購自天津南開大學(xué)樹脂廠；AB-8樹脂，購自杭州爭光樹脂有限公司；層析柱Ф1.6×20cm，Ф2.0×30cm；SG2型pH計；高效液相色譜；BS-1E型恒溫振蕩培養(yǎng)箱；乙醇、甲醇、氯化氫、氫氧化鈉、三氯化鋁均為分析純。

2 試驗方法

2.1 樹脂的預(yù)處理

預(yù)處理方法參照文獻(xiàn)[7]。

2.2 分離步驟

首先提取樣品；選擇最適合的大孔樹脂型號；進(jìn)行吸附原液pH值和流速的考查；確定解析劑、洗脫劑濃度、洗脫流速和洗脫劑用量。

2.3 大孔樹脂篩選

7種樹脂的性能參數(shù)見表1。

2.4 吸附試驗

準(zhǔn)確稱取經(jīng)過預(yù)處理的7種干樹脂各20mL，型號分別為1，2，3，4，5，6，7，分別加入200 mL已知濃度（C1）的樣品液，在30℃、120 r/min條件下24 h。測定濾液中的黃酮濃度（C2）。樹脂吸附率參照文獻(xiàn)[8]計算。

表1 7種樹脂的性能參數(shù)

2.4.1 大孔樹脂洗脫率

計算解吸率參照文獻(xiàn)[8]。

2.4.2 吸附溫度對吸附量的影響

選擇吸附溫度分別為25，35，45，55，65℃進(jìn)行試驗，不同溫度條件下放置恒溫振蕩箱中進(jìn)行12 h培養(yǎng)，期間每1 h吸取1次上層溶液對樹脂吸附液進(jìn)行檢測，以吸附率為檢驗指標(biāo)。

2.4.3 吸附時間對吸附量的影響

將預(yù)處理好的樣品，振蕩吸附12 h，間隔1 h吸取1次上層溶液檢測，以吸附率為檢驗指標(biāo)進(jìn)行計算。

2.4.4 洗脫溫度對洗脫率的影響

濾出飽和吸附沙棘葉總黃酮的樹脂一定量，設(shè)置振搖溫度分別為25，35，45，55，65℃。洗脫結(jié)束后，吸取上層液檢測，以洗脫率為檢驗指標(biāo)進(jìn)行計算。

2.4.4 洗脫時間對洗脫率的影響

濾出飽和吸附沙棘葉總黃酮的樹脂10mL，振搖洗脫8 h，間隔1 h吸取1次上層溶液檢測，以洗脫率為檢驗指標(biāo)進(jìn)行計算。

2.4.5 乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對洗脫的影響

濾出飽和吸附沙棘葉總黃酮的樹脂20mL，分別加入不同體積分?jǐn)?shù)為35%，45%，55%，65%，75%，85%乙醇200 mL，振蕩洗脫。吸取上層洗脫液進(jìn)行檢測，以洗脫率為檢驗指標(biāo)進(jìn)行計算。

2.4.6 沙棘葉總黃酮的HLPC檢測

沙棘葉總黃酮的檢測參考易昌華等人的方法[9]。

2.4.7 沙棘葉總黃酮的純度計算

式中：S1——沙棘葉總黃酮的質(zhì)量，g；

S2——凍干后沙棘葉總黃酮的質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 樹脂篩選

不同型號大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解析見表2。

表2 不同型號大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解析

由表2可知，各樹脂吸靜態(tài)吸附效果最佳的為3號，其次是6，2，7號，洗脫率最佳的樹脂為3號，其次是6，3號，從吸附、解析2個方面來看6，2，3號3種樹脂效果都有優(yōu)勢。經(jīng)綜合對比選出最適合的樹脂。

3.2 吸附溫度的選擇

不同吸附溫度對吸附率的影響見圖1。

圖1 不同吸附溫度對吸附率的影響

由圖1可看出，隨著吸附溫度不斷的升高，3種樹脂的吸附率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，從圖中也能看出，在溫度在25～35℃ 3種樹脂的吸附率均達(dá)到最高。由此可得，在同一溫度條件下，3號樹脂的吸附率明顯高于其他2種。

3.3 吸附時間的選擇

不同吸附時間對吸附率的影響見圖2。

圖2 不同吸附時間對吸附率的影響

由圖2可看出，隨著吸附時間的增加，吸附率呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢，當(dāng)吸附時間為3 h時，3種樹脂的吸附率均達(dá)到最高，在同一時間下對比，3號的吸附率幾乎高于其他2種。

3.4 洗脫溫度的選擇

不同解析溫度對洗脫率的影響見圖3。

圖3 不同解析溫度對洗脫率的影響

由圖3可看出，隨著洗脫溫度的增加，洗脫率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，從圖中也能夠看出，在不同的溫度下，3號樹脂的洗脫率均高于6，2號2種樹脂。故最優(yōu)樹脂為2-X-5。

3.5 洗脫時間的選擇

不同解析時間對洗脫率的影響見圖4。

圖4 不同解析時間對洗脫率的影響

由圖4可看出，隨著洗脫時間的升高，3種樹脂的洗脫率呈現(xiàn)先上升后下下降的趨勢。在洗脫時間為2.5 h時，3種樹脂的洗脫率均達(dá)到最高，經(jīng)同一時間對比，3號樹脂的洗脫率均高于其他2種樹脂。

3.6 乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)的選擇

不同乙醇濃度對解析率的影響見圖5。

圖5 不同乙醇濃度對解析率的影響

由圖5可看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，解析率呈現(xiàn)先上升直至平緩的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時，3種樹脂的解析率幾乎達(dá)到最高。經(jīng)同一乙醇體積分?jǐn)?shù)對比，3號樹脂的解析率均高于其他2種。

經(jīng)以上因素的綜合考慮，確定選擇3號樹脂進(jìn)行后續(xù)試驗，最佳條件為靜態(tài)吸附條件為吸附時間3 h，吸附溫度25℃，靜態(tài)解析條件為解析時間2.5 h，解析溫度25℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%。

3.7 高效液相法（HPLC）檢測大孔樹脂分離沙棘葉中的總黃酮量

樹脂純化的沙棘葉總黃酮HPLC圖見圖6。

圖6 樹脂純化的沙棘葉總黃酮HPLC圖

由圖6可看出，為經(jīng)過3號樹脂純化后沙棘葉中黃酮總量的高效液相檢測圖譜，根據(jù)圖譜中的峰面積和公式進(jìn)行計算，確定沙棘葉中的黃酮純度為89.72%。

4 結(jié)論

選用7種樹脂作為研究對象，通過比較這7種樹脂對沙棘葉總黃酮的吸附效果，確定3號、6號和2號樹脂吸附解析效果好。以吸附時間、吸附溫度、洗脫時間、洗脫溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)為試驗因素對3種樹脂進(jìn)行比較，可得3號樹脂最優(yōu)，并確定最佳條件為為靜態(tài)吸附條件為吸附時間3 h，吸附溫度25℃，靜態(tài)解析條件為解析時間2.5 h，解析溫度25℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%。在此條件下分離的沙棘葉黃酮經(jīng)HPLC檢測濃度為89.72%。

[1]鄭潔.蜂膠中黃酮類化合物的富集分離研究 [D].無錫：江南大學(xué)，2007.

[2]趙玉珍.沙棘中黃酮類化合物及其藥用價值 [J].沙棘，1997（1）：43-47.

[3]孫天宇，楊宏志.超聲波法提取沙棘葉總黃酮最佳工藝的研究 [J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2012，24（3）：45-50.

[4]趙玉琪，殷麗君.沙棘葉黃酮的提取及其對抗氧化性的影響 [J].食品工業(yè)科技，2006（4）：71-72.

[5]朱紅梅，趙猛，王文輝，等.酶法提取沙棘葉中黃酮的研究 [J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2008，28（6）：30-32.

[6]潘見，陳強(qiáng)，謝慧明，等.大孔樹脂對葛根黃酮的吸附分離特性研究 [J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，1999，15（1）：236-240.

[7]Fu B，Liu J，Li H，et al.The application ofmacroporous resins in the separation of licorice flavonoids and glycyrrhizic acid[J].Journal of Cliromatography A，2005（1-2）：18-24.

[8]王晶，周禾.植物黃酮類化合物生物學(xué)功能及浸提純化[J].中國飼料，2006（11）：24-27.

[9]易昌華，賀建華，戴球仲.中草藥提取物中總黃酮含量測定 [J].湖南飼料，2004（4）：35-36.◇