位庚 曹柳 張?zhí)K明 侯鳳英 趙玉莎 何素彥

[摘要] 目的 探討通心絡(luò)對(duì)高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCECs）損傷的干預(yù)作用及其相關(guān)機(jī)制。 方法 用高糖培養(yǎng)基建立細(xì)胞損傷模型，采用隨機(jī)數(shù)字表法將HRCECs分為正常對(duì)照組（normal組）、模型組（model組，30 mmol/L葡萄糖）、通心絡(luò)低劑量組（TXL-L組，100 μg/mL通心絡(luò)）、通心絡(luò)中劑量組（TXL-M組，200 μg/mL通心絡(luò)）、通心絡(luò)高劑量組（TXL-H組，400 μg/mL通心絡(luò)）。檢測(cè)各組細(xì)胞生存活性，細(xì)胞上清液內(nèi)皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）和細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）含量，以及細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 與normal組比較，model組細(xì)胞生存活性明顯降低，細(xì)胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量升高，細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)下調(diào)，NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)（P < 0.01）;與model組比較，TXL-M組和TXL-H組細(xì)胞上清液ET-1含量明顯減少（P < 0.01），TXL-L組、TXL-M組和TXL-H組細(xì)胞上清液IL-6和ICAM-1含量明顯減少，eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)，NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 通心絡(luò)可明顯改善高糖誘導(dǎo)的HRCECs損傷，并通過(guò)減輕炎癥損傷發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 通心絡(luò);人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞;高糖;炎癥

[中圖分類號(hào)] R774;R285.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2018）12（c）-0012-04

[Abstract] Objective To explore the intervention effects and related mechanism of Tongxinluo on high glucose-induced human retinal capillary endothelial cells （HRCECs） injury. Methods The cells damaged model was established with high glucose. The HRCECs were divided into normal group， model group （30 mmol/L glucose）， Tongxinluo low dose group （TXL-L group， 100 μg/mL Tongxinluo）， Tongxinluo middle dose group （TXL-M group， 200 μg/mL Tongxinluo） and TXL high dose group （TXL-H group， 400 μg/mL Tongxinluo） by random number table method. The cell viability， contents of endothelin （ET）-1， interleukin （IL）-6 and intercellular adhesion molecule （ICAM）-1 in supernatant， and the endothelial nitric oxide synthase （eNOS） and nuclear factor （NF）-κB protein expression in cells of each group were detected. Results Compared with normal group， the cell viability was significantly decreased， the contents of ET-1， IL-6 and ICAM-1 in supernatant were significantly increased， the protein expression of eNOS was significantly down-regulated， and the protein expression of NF-κB was significantly up-regulated in model group （P < 0.01）. Compared with model group， the contents of ET-1 in supernatant were significantly decreased in TXL-M group and TXL-H group （P < 0.01）， and the contents of IL-6 and ICAM-1 in supernatant were significantly decreased， the protein expression of eNOS was significantly up-regulated， and the protein expression of NF-κB was significantly down-regulated in TXL-L group， TXL-M group and TXL-H group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Tongxinluo can signifcantly improve high glucose-induced HRCECs injury， and plays a role in cell protection through reducing inflammatory injury.

[Key words] Tongxinluo; Human retinal capillary endothelial cells; High glucose; Inflammation

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）為糖尿病最為嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，已成為成年人致盲的主要原因，并且發(fā)病率還在逐年增加。高血糖被認(rèn)為是導(dǎo)致DR的重要因素，持續(xù)高血糖誘發(fā)的視網(wǎng)膜組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是DR出現(xiàn)血管病理改變的始動(dòng)因素[1]。中藥復(fù)方制劑通心絡(luò)膠囊，在中醫(yī)絡(luò)病理論指導(dǎo)下研制而成，對(duì)微血管有較好的保護(hù)作用[2-4]。已有臨床研究顯示，通心絡(luò)對(duì)DR有較好的治療作用[5-6]，但其對(duì)視網(wǎng)膜微血管的作用機(jī)制尚不十分清楚。本研究選用人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal capillary endothelial cells，HRCECs）為研究對(duì)象，高糖誘導(dǎo)HRCECs損傷，模擬人體內(nèi)高糖環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜微血管的影響，觀察通心絡(luò)對(duì)該損傷的干預(yù)作用及其作用機(jī)制，為通心絡(luò)應(yīng)用于DR的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞

HRCECs購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司。

1.2 藥物及試劑

通心絡(luò)藥粉由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供（批號(hào)：S-130901）;內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM）（美國(guó)ScienCell公司，批號(hào)：1001）;CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)：KN868）;內(nèi)皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）及細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20160804、20150916、20160808）;內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）p65抗體（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab76198、ab16502）。

1.3 主要儀器

Effendrof Centrifuge 5804R離心機(jī)（德國(guó)Effendrof公司）;YP502N電子天平（上海菁海儀器有限公司，讀數(shù)精度：0.01 g）;多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）;UVP凝膠掃描系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）;電轉(zhuǎn)膜儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、垂直電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4 藥物配制

1.5 細(xì)胞分組及處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為以下五組（每組平行設(shè)置3～4個(gè)復(fù)孔）：①正常對(duì)照組（normal組），正常培養(yǎng);②模型組（model組），含30 mmol/L葡萄糖的ECM無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng);③通心絡(luò)低劑量組（TXL-L組），含通心絡(luò)100 μg/mL的無(wú)血清ECM培養(yǎng)基預(yù)孵育4 h后，換為含葡萄糖30 mmol/L加通心絡(luò)100 μg/mL的無(wú)血清ECM培養(yǎng)基;④通心絡(luò)中劑量組（TXL-M組），含通心絡(luò)200 μg/mL的無(wú)血清ECM培養(yǎng)基預(yù)孵育4 h后，換為含葡萄糖30 mmol/L加通心絡(luò)200 μg/mL的無(wú)血清ECM培養(yǎng)基;⑤通心絡(luò)高劑量組（TXL-H組），含通心絡(luò)400 μg/mL的無(wú)血清ECM培養(yǎng)基預(yù)孵育4 h，換為含葡萄糖30 mmol/L加通心絡(luò)400 μg/mL的無(wú)血清ECM培養(yǎng)基。以上五組細(xì)胞處理完畢后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 CCK-8法檢測(cè)HRCECs生存活性

接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的HRCECs按照“1.5”項(xiàng)處理后，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入含CCK-8的無(wú)血清ECM培養(yǎng)基100 μL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處OD值[8]。以各組OD值與normal組的比值行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)HRCECs上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量

接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的HRCECs按“1.5”項(xiàng)處理后，收集各組細(xì)胞上清液，1.5 mL無(wú)菌EP管中1000 r/min（r = 8.7 cm）離心2 min取上清液。ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1的含量，實(shí)驗(yàn)中操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.8 Western blot法檢測(cè)eNOS和NF-κB蛋白表達(dá)

接種于直徑為6 cm細(xì)胞皿的HRCECs按“1.5”項(xiàng)處理后，培養(yǎng)皿內(nèi)加入40 μL細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解，超聲破碎后放入離心機(jī)內(nèi)離心，收集上清液，蛋白定量后取等量蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜，封閉液中封閉，一抗孵育，二抗孵育，以GAPDH作為內(nèi)參，將各目的蛋白吸光度值與GAPDH吸光度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊時(shí)，采用最小顯著差法（LSD），若方差不齊，采用Dunnett′s T3法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞生存活性和細(xì)胞上清液中ET-1、IL-6、ICAM-1含量比較

與normal組比較，model組細(xì)胞生存活性明顯降低，細(xì)胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量明顯升高（P < 0.01）;與model組比較，TXL-L組、TXL-M組和TXL-H組細(xì)胞生存活性明顯升高，細(xì)胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯降低，TXL-M組和TXL-H組細(xì)胞上清液中ET-1含量明顯降低（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 各組人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS和NF-κB蛋白表達(dá)比較

與normal組比較，model組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，NF-κB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P < 0.01）;與model組比較，TXL-L組、TXL-M組和TXL-H組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)，NF-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表2、圖1。

3 討論

DR是糖尿病最常見(jiàn)和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，其基本的病理改變?yōu)槲⒀軆?nèi)皮細(xì)胞損傷、基底膜增厚、內(nèi)皮細(xì)胞增生、新生血管形成等[9]，后期可形成微血栓甚至引起微血管閉塞[10]。這些微血管的病變屬于中醫(yī)“絡(luò)病”理論研究的范疇，治療上應(yīng)以化瘀通絡(luò)為主，通心絡(luò)是在中醫(yī)絡(luò)病理論指導(dǎo)下組方而成，由人參、全蝎、水蛭、土鱉蟲、蟬蛻、蜈蚣、赤芍、酸棗仁等藥物組成，具有化瘀通絡(luò)、益氣活血等功效。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通心絡(luò)具有降脂、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等作用[11-12]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通心絡(luò)對(duì)KK/Upj-Ay小鼠視網(wǎng)膜組織具有保護(hù)作用[13]，亦有臨床試驗(yàn)表明通心絡(luò)治療DR效果確切。

本研究選用高糖誘導(dǎo)HRCECs損傷作為研究糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變的模型，高糖能降低HRCECs的生存活性，TXL-L組、TXL-M組和TXL-H組均能升高HRCECs的生存活性，生存活性的提高是保證血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)條件，說(shuō)明通心絡(luò)對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變具有一定的防治作用。一氧化氮（NO）對(duì)血管有保護(hù)作用，參與維持血管的正常張力，為內(nèi)皮細(xì)胞合成的主要舒血管物質(zhì)，它的前體是L-精氨酸，由一氧化氮合酶（NOS）催化合成，內(nèi)皮細(xì)胞中存在的是eNOS，由于NO具有不穩(wěn)定性，故本研究檢測(cè)eNOS的蛋白表達(dá)以間接反映NO的含量。ET-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放，具有收縮血管的作用[14]。在生理狀態(tài)下，NO和ET-1的含量在局部保持動(dòng)態(tài)平衡。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)HRCECs后，細(xì)胞上清液中ET-1含量明顯升高，細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明NO和ET-1之間的平衡狀態(tài)被打破，內(nèi)皮細(xì)胞功能受到了損傷，通心絡(luò)不同劑量干預(yù)后，細(xì)胞上清液中ET-1含量明顯降低，細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且呈現(xiàn)劑量依賴性，提示通心絡(luò)對(duì)HRCECs的分泌功能起到了保護(hù)作用。

DR的發(fā)生機(jī)制與持續(xù)性高血糖、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等因素相關(guān)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥在DR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用，該觀點(diǎn)的提出為治療DR提供了新方向[15]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-1β和ICAM-1等多種炎癥因子之間的相互作用影響了DR的發(fā)展。IL-6作為前炎癥因子，在炎性反應(yīng)中起著重要的作用[16]，ICAM-1是主要的黏附分子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中可釋放自由基、細(xì)胞因子，亦有研究顯示內(nèi)皮細(xì)胞的損傷或死亡部分繼發(fā)于ICAM-1介導(dǎo)白細(xì)胞黏附于視網(wǎng)膜血管。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子之一，能夠調(diào)控包括IL-6和ICAM-1在內(nèi)的多種炎性細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[17]。高糖、缺氧等均能激活NF-κB，活化的NF-κB可上調(diào)黏附分子的表達(dá)，使白細(xì)胞瘀滯、黏附于視網(wǎng)膜血管，引起一系列視網(wǎng)膜病變。本研究中，model組細(xì)胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯升高，細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，通心絡(luò)不同劑量干預(yù)后，細(xì)胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯降低，細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。提示通心絡(luò)能夠抑制高糖誘導(dǎo)HRCECs損傷炎性因子的高表達(dá)可能是通過(guò)抑制NF-κB途徑實(shí)現(xiàn)的。

高效液相色譜和氣相色譜的指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)證實(shí)，通心絡(luò)膠囊的主要成分為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、芍藥苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B等。有研究表明，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用[18-19]，而芍藥苷可減輕內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)[20]。所以本研究推測(cè)，通心絡(luò)對(duì)HRCECs的功能受損和炎性反應(yīng)的保護(hù)作用與此相關(guān)，但通心絡(luò)中是何成分起主要作用還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，高糖可誘導(dǎo)HRCECs發(fā)生功能障礙及炎性反應(yīng)，通心絡(luò)可抑制該過(guò)程，其作用機(jī)制可能與通心絡(luò)抑制NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)。

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（收稿日期：2018-02-02 ?本文編輯：張瑜杰）