許曉輝，邱國玉，初 明，王小喬，朱天虹，李晨曦， 閆 君，趙 波

(1蘭州市食品藥品檢驗所,甘肅蘭州730050；2北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京100191)

0 引言

仿制藥與原研藥只是主藥成分的分子結(jié)構(gòu)相同,而仿制藥與原研藥中輔料、處方工藝等不同,由此兩者存在療效差異,因此,仿制藥需開展一致性評價研究。仿制藥一致性評價,是《國家藥品安全“十二五”規(guī)劃》中的一項藥品質(zhì)量要求,旨在提高仿制藥質(zhì)量,要求仿制藥質(zhì)量和療效方面要與原研藥品保持一致,達(dá)到在臨床上可替代原研藥的療效,其一致性評價具體要求是仿制藥與原研藥雜質(zhì)譜一致、穩(wěn)定性一致、體內(nèi)外溶出規(guī)律等一致。為了提高我國仿制藥質(zhì)量,推進(jìn)仿制藥事業(yè)發(fā)展,2016年2月,國務(wù)院正式發(fā)布了《關(guān)于推進(jìn)仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價的意見》,部署了企業(yè)開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價工作,明確要求各藥品生產(chǎn)企業(yè)在2018年底之前完成2007年10月1日前批準(zhǔn)的國家基本藥物目錄中化學(xué)藥品仿制藥口服固體制劑共289個品種的一致性評價。而拉曼光譜技術(shù)作為一種綠色的定性定量分析方法,《中國藥典》2010年版已將其收錄入附錄。目前,對于應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)對仿制藥進(jìn)行研究主要集中在原料藥/輔料結(jié)構(gòu)、晶型、粒度、組分分析、處方工藝等方面。

1 拉曼光譜技術(shù)概述

拉曼散射現(xiàn)象最早由印度科學(xué)家拉曼發(fā)現(xiàn),它是基于拉曼散射原理的分子振動光譜,是研究化合物分子受到光照射后所產(chǎn)生的散射光、入射光的能級差與化合物振動頻率、轉(zhuǎn)動頻率相互關(guān)系的分析方法,通過測量拉曼散射光中特定譜成分的相對強(qiáng)弱,可以獲得被測分子或者體系的相關(guān)信息。拉曼散射實際上就是非彈性散射,分為斯托克斯散射和反斯托克斯散射兩種,斯托克斯散射為光經(jīng)過散射后頻率減小,反斯托克斯散射為光經(jīng)過散射后頻率增大。斯托克斯散射和反斯托克斯散射的強(qiáng)度遠(yuǎn)小于瑞利散射,這也是在之前的實驗中未被發(fā)現(xiàn)的原因。這其中斯托克斯散射要強(qiáng)于反斯托克斯散射,拉曼散射主要由斯托克斯散射構(gòu)成。待測分子本身具有特定的不同的振動模式,因此入射光在經(jīng)過待測分子后會發(fā)生不同程度的改變,通過對這些波長的改變進(jìn)行測定,我們可以得到對特定分子唯一的拉曼光譜,從而對待測物質(zhì)進(jìn)行定性的研究。

目前研究分子振動的主要方法有紅外光譜和拉曼光譜。與紅外光譜相比,拉曼光譜在很多領(lǐng)域具有其特有的優(yōu)勢。比如拉曼光譜是一種無損檢測技術(shù),對樣品狀態(tài)幾乎沒有要求,不需要樣品預(yù)處理,樣品可通過光纖探頭或者通過玻璃、石英直接測量；其次,水分子對拉曼散射幾乎沒有吸收,可用作水溶液中分子的檢測,是一種理想工具用來研究水溶液中的化學(xué)化合物；同時,拉曼信號不受入射光激光波長的影響,只取決于待測分子的振動轉(zhuǎn)動能級；再者,拉曼光譜可以一次同時覆蓋4000～50波數(shù)區(qū)間,可對有機(jī)物化合物進(jìn)行定性定量分析,所得譜圖具有清晰尖銳的譜峰,比較適合通過差異分析來進(jìn)行定性研究、定量研究以及數(shù)據(jù)庫搜索［1－3］。另外,高度可極化的官能團(tuán)是拉曼信號的主要來源,非對稱的、具有高偶極矩的基團(tuán)不能產(chǎn)生強(qiáng)的拉曼散射,而大多數(shù)藥物分子都具有可極化的官能團(tuán),因此有著很好的拉曼散射效應(yīng)。拉曼光譜能夠反映多晶型藥物分子的結(jié)構(gòu)信息,拉曼光譜的展寬小、分辨率高、峰形尖銳,可降低大分子輔料的干擾而實現(xiàn)對原輔料制劑的直接分析,同時,拉曼光譜對結(jié)構(gòu)變化非常靈敏,細(xì)微的分子間作用力的改變也能在譜圖中體現(xiàn)。圖1為拉曼光譜儀的基本結(jié)構(gòu),主要包括光源、濾光系統(tǒng)、光波處理系統(tǒng)、樣品裝置和檢測器［4］。

2 拉曼光譜在仿制藥一致性評價研究中的應(yīng)用

2.1 藥物制劑中主藥晶型研究 仿制藥研究首先要找到原研制劑的處方、工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等,若實在找不到,可通過反向工程進(jìn)行研究,既對原研藥進(jìn)行逆向分析,從而得出定性配方、原料藥的晶型、輔料的含量及制備工藝等要素,因此原輔料的物理性質(zhì)研究是處方前研究的重要內(nèi)容,而晶型又影響著原輔料的理化性質(zhì),直接影響藥物的溶解性、生物利用度與療效。而原研藥公司為了使自己研發(fā)的藥品具有更長時間的市場獨享權(quán)而對藥物分子的晶型都申請專利,這樣可以延長藥物的專利保護(hù)。對仿制藥公司來說,為了確保仿制藥和原研藥具有生物等效性,也需要對原料藥的晶型進(jìn)行研究,以確保原料藥和制劑的質(zhì)量能夠替代原研藥,正因為如此美國藥監(jiān)局在ANDA申報中也對仿制藥多晶型控制有明確的指南。另外,仿制藥公司只有開發(fā)出藥物的新晶型才能夠打破原研藥公司對晶型的專利保護(hù),提早將仿制藥推向市場,因此,晶型篩選是突破原研專利最有效的方式之一,更夠直接或間接帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。如果能找到在生物利用度、穩(wěn)定性以及生產(chǎn)工藝等方面具有優(yōu)越性的藥物新晶型,通過晶型篩選可以發(fā)現(xiàn)有利于發(fā)揮藥效作用的藥物優(yōu)勢晶型,改善藥物的溶出和生物利用度,減小藥物毒性或根據(jù)晶型特點確定制劑工藝等,還可以申請晶型專利保護(hù)仿制藥制劑處方工藝研究。另一方面,有些藥物晶型很不穩(wěn)定,需要考慮晶型的穩(wěn)定性,嚴(yán)格控制操作過程和環(huán)境條件確保晶型不發(fā)生改變。而制劑中晶型檢測主要通過X射線粉末衍射和拉曼光譜進(jìn)行檢測分析,通過對制劑中檢測到的活性成分(API)的X射線粉末衍射圖譜與參照圖譜對比,分析活性成分特征峰來判斷制劑中晶型歸屬,但是通常受到輔料干擾較大,比較難區(qū)分化學(xué)原料藥晶型之間的特征峰。另外,對于活性成分為無定形的藥物且制劑中同樣含有無定形輔料或者半水合物的情況下,X射線粉末衍射就比較局限了。而拉曼光譜法適用于制劑中低含量活性成分晶型檢測,其光斑直徑小,且通常情況下活性成分拉曼信號要強(qiáng)于輔料信號,因此,可以很大程度上的避免輔料的干擾。應(yīng)用拉曼光譜技術(shù),可以研究原研藥與仿制藥的拉曼光譜圖,通過拉曼光譜信號可以確定原研藥與仿制藥中化學(xué)原料藥晶型不一致,這將可能提示仿制藥與原研藥生物不等效。因此,拉曼技術(shù)為原研藥制劑中晶型分析,尤其是對無定形化學(xué)原料藥和低含量劑型等復(fù)雜條件下的晶型分析提供了解決之道,是一致性評價工作中的一大利器。近年來,計算機(jī)輔助預(yù)測藥物晶型在開發(fā)仿制藥新晶型方面有了較大應(yīng)用進(jìn)展,基于商業(yè)程序Polymorph Predictor,在固體藥物結(jié)構(gòu)明知的前提下,通過計算點陣能量最小化方法探索藥物結(jié)構(gòu)能量上可能存在的晶體結(jié)構(gòu)和分子排列規(guī)律,并將它們按能量大小排列,計算出不同能量條件下最可能生成的晶型,但該方法目前在研究藥物晶型中的成功率還較低。另一方面,拉曼光譜技術(shù)也被應(yīng)用到固體藥物制劑分散體結(jié)晶動力學(xué)研究,如有研究者采用實時拉曼光譜法對卡維地洛的溶劑介導(dǎo)多態(tài)轉(zhuǎn)變和冷卻結(jié)晶進(jìn)行了研究,論證了在線拉曼光譜技術(shù)在原位藥物結(jié)晶分析中的優(yōu)勢［5］,也有研究者應(yīng)用拉曼光譜研究了不同活性藥物成分/聚乙二醇(API/PEG)固體分散體的結(jié)晶動力學(xué),與純原料藥相比,苯佐卡因/聚乙二醇(BZC/PEG)(20/80 wt%)固體分散體中的苯佐卡因結(jié)晶速率明顯降低,而PEG基體對氟哌啶醇(HLP)的結(jié)晶行為沒有影響［6］,當(dāng)然這些拉曼光譜在這些領(lǐng)域的探索,都可以應(yīng)用到仿制藥一致性評價研究中。石云峰等人［7］采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀測定西尼地平片兩種可能的α、β晶型(已經(jīng)X-衍射鑒定)、原研藥、國內(nèi)仿制藥的拉曼圖譜,確定國內(nèi)仿制藥和原研藥的晶型情況,結(jié)果顯示結(jié)果國內(nèi)A、B 2家企業(yè)產(chǎn)品為α晶型,原研藥和國內(nèi)C企業(yè)產(chǎn)品為無定型,國內(nèi)仿制藥和原研藥晶型存在一定差異,其結(jié)果見圖2。

2.2 藥物制劑中粒度分析 在仿制藥一致性評價研究過程中,粒度是API、輔料和制劑中間體的粉體學(xué)研究的重要技術(shù)指標(biāo)。原輔料的粒度會影響藥物制劑的物理、化學(xué)、生物行為,決定藥物的含量均勻度、溶出速率,體內(nèi)生物利用度。對于難溶性藥物制劑,粒度分布的控制非常關(guān)鍵。全球在售藥物中難溶性藥物占40%,而這一數(shù)字在在研藥物中高達(dá)90%。因此,如何提高難溶性藥物的溶解性是制劑工藝的重點和難點,也是仿制藥一致性評價研究中處方工藝研究的重要內(nèi)容。目前,有多種粒度測量儀器,如激光衍射粒度分析儀、庫爾特計數(shù)儀、顆粒圖像處理儀器等,而拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于藥物粒度分析是近年來發(fā)展起來的一個新研究領(lǐng)域,甚至可以將拉曼光譜與光學(xué)顯微鏡和光學(xué)捕獲耦合起來,實現(xiàn)顯微長度的測量,對于一些高空間分辨率的無熒光表征的有機(jī)樣品和復(fù)雜樣品,利用近紅外激發(fā)光源照射上述樣品,在該波長上能夠發(fā)出強(qiáng)烈的熒光,能夠分析熒光強(qiáng)度大于1064 nm 的粒子［8］。 趙海云等人［9］基于圖像導(dǎo)向的拉曼光譜技術(shù),研究了國產(chǎn)仿制藥來氟米特片與參比制劑(SANOFI)的粒度,作者先用拉曼光譜光學(xué)成像系統(tǒng)測量來氟米特片崩解液中顆粒的粒徑和形狀參數(shù),然后采用拉曼光譜區(qū)分崩解液中API顆粒和輔料顆粒,獲得API顆粒的粒度和粒形分布結(jié)果,并比較國產(chǎn)來氟米特片和參比制劑在崩解后的粒徑和粒形差異。結(jié)果顯示,國產(chǎn)仿制藥來氟米特片崩解液中來氟米特API粒徑D(v,50)為79.8μm,參比制劑崩解液中API粒徑D(v,50)為17.6μm,且國產(chǎn)來氟米特片崩解液中發(fā)現(xiàn)較多API顆粒與輔料呈包結(jié)大顆粒狀態(tài),因此在開展來氟米特片仿制藥質(zhì)量一致性評價時,應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化處方、生產(chǎn)工藝。

2.3 藥物制劑中成分分析 在原研藥制劑中,如何準(zhǔn)確判斷某些含量極低組分的存在性則成為逆向工程分析的關(guān)鍵點?；诶上?可通過多種數(shù)學(xué)運算轉(zhuǎn)換為樣品組分圖像從而得到圖譜結(jié)果。將在制劑上測得的所有拉曼圖譜與每個單獨組分的特征光譜相對比是鑒定制劑中各成分最簡單的方法,如果某組分至少有一個不與其他組分重疊的特征峰能夠被檢測到,就能判斷出該組分的存在,如下圖3研究結(jié)果所示,研究者首先用來氟米特原料藥和輔料純物質(zhì)建立拉曼光譜數(shù)據(jù)庫,選擇掃描區(qū)域內(nèi)的顆粒自動進(jìn)行拉曼光譜分析,將所分析顆粒的拉曼譜圖與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,從而確定原料藥與輔料的拉曼光譜峰［9］,但實際情況中這種現(xiàn)象很少出現(xiàn)。通常,由不同的API及輔料組成的制劑,并且,這些成分顆粒小,混合均勻,因此這種制劑的拉曼成像光譜是多種成分信號的重疊。通過多變量分析法可以有效區(qū)分不同成分的特征峰,例如主成分分析法(PCA),直接經(jīng)典最小二乘法(DCLS)等,可以提取有效信息,從而進(jìn)行分析。拉曼顯微光譜作為固體制劑無損分析手段已經(jīng)應(yīng)用于藥學(xué)領(lǐng)域,與傳統(tǒng)技術(shù)相比,拉曼顯微光譜的最大優(yōu)勢在于它不破壞固體制劑的空間結(jié)構(gòu)可以“無損性”地分析其化學(xué)成分,還能通過對被分析物不同橫截面的表征,分析不同規(guī)格、形狀樣品的內(nèi)部信息,得到API及輔料在制劑不同區(qū)域的分布,這種“無損性”分析技術(shù)所帶來的“表面”分析信息是常規(guī)的破壞性溶液分析技術(shù)如薄層色譜、分子排阻色譜、高效液相色譜所無法實現(xiàn)或替代的。如共聚焦拉曼顯微鏡也可以對藥物進(jìn)行化學(xué)成像,主要是對劑型中的活性成分和賦形物進(jìn)行空間成像,在低濃度配方中,根據(jù)空間成像快速鑒別主藥和輔料［10］。對于包衣、多層次等復(fù)雜制劑,當(dāng)不同廠家同一藥品中的API分布區(qū)域不同時,可能說明不同廠家同一藥品所采用的生產(chǎn)工藝不一樣,而分布狀態(tài)和制備工藝的差別也可能直接暗示著不同廠家所生產(chǎn)的制劑在溶出行為方面存在差異,生物等效性方面存在差異。拉曼光譜儀也可與其他儀器聯(lián)用用于仿制藥成分分析,如液相色譜-表面增強(qiáng)拉曼光譜聯(lián)用儀(LC-SERS),盡管目前僅限于等速洗脫。雖然一些有機(jī)分析物可用于LC和LC-MS分析,但是LC-SERS方法的一個主要優(yōu)點是它適用于分析沒有紫外線吸收或不能夠電離碎裂的分析物［11］。

圖3 來氟米特原料藥與輔料的拉曼光譜

2.4 溶出度研究 溶出度試驗在評價仿制藥與原研藥生物等效性方面發(fā)揮著重要的作用,其是模擬固體口服制劑在胃腸道中崩解和溶出的理想體外試驗法,是評價和控制藥品固體口服制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)。目前藥典中提供的傳統(tǒng)溶出度測定方法僅能有限地反映藥物在體內(nèi)的動態(tài)溶出過程,常用的溶出度測定方法是紫外光譜法和液相色譜法［12］。由于拉曼光譜可用于測定水中的目標(biāo)化合物,其已被應(yīng)用到藥物溶出度測定領(lǐng)域,無損快捷的優(yōu)點使拉曼光譜有望成為溶出度測定的可選方法之一,美國藥典中已收錄了拉曼光譜法測定林可霉素溶出度的方法［13］。

3 總結(jié)

目前,拉曼光譜及其與其他技術(shù)相結(jié)合越來越多應(yīng)用到仿制藥一致性評價研究中,其表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性。研究表明,拉曼光譜技術(shù)在仿制藥一致性評價研究中,小分子藥物的拉曼光譜特征很明顯,拉曼峰分布較廣,對其進(jìn)行光譜識別簡單易行；而大分子都表現(xiàn)出較弱的光譜特征峰,常常伴隨復(fù)雜的包絡(luò),不僅導(dǎo)致了對其光譜識別的困難,也很難準(zhǔn)確確定特征峰位置［14］。鑒于仿制藥一致性評價中,制劑成分的復(fù)雜性所得拉曼光譜數(shù)據(jù)的復(fù)雜性,因此將拉曼光譜分析方法、數(shù)據(jù)采集與其他新型分析方法、數(shù)據(jù)處理方法(如主成分分析法、多項式擬合和非線性最小二乘法等)相結(jié)合來解析研究對象是拉曼光譜技術(shù)待解決的問題［15］。