王志宇，王國艷，薛俊龍，張偉業(yè)，孫仰介，劉 源

（山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

大腸桿菌因血清型復雜而又具較強變異性，接種疫苗效果不佳，因而在生產中多采用抗生素防治。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛、持續(xù)應用，大腸桿菌耐藥水平隨之提高，尤其是多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給抗菌治療帶來了困難，給養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的經濟損失[1-2]。大腸桿菌的多重耐藥主要是由外膜通透性改變和主動外排系統(tǒng)共同作用的結果。其中，主要是外排泵系統(tǒng)（AcrAB-TolC）[3-8]與多重耐藥有關。

本研究通過采集近年來山西各地不同的大腸桿菌菌株，在實驗室分離純化培養(yǎng)，篩選出30株多重耐藥的菌株作為研究對象，選取影響大腸桿菌多重耐藥的基因AcrA[9-11]，并結合喹諾酮類耐藥基因qnrA[12-14]和 ESBLs（超廣譜 β- 內酰胺酶）[15-16]相關耐藥基因TEM[17-18]進行了初步分子生物學分析，旨在了解近年來山西省雞源大腸桿菌的耐藥機理，豐富山西省大腸桿菌病分子流行病學特征，也為今后生產實踐中更好地防控大腸桿菌疫病奠定一定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

病料采集于2016—2017年山西省部分地區(qū)疑似大腸桿菌病的病死雞。細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR擴增試劑購自Taraka寶生物（大連）；引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司；革蘭陰性需氧菌鑒定板和腸桿菌藥敏板購自上海復星佰珞生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大腸桿菌的培養(yǎng)鑒定及藥敏 從病料采集菌株并分離純化，初步篩選革蘭氏陰性桿菌，使用微生物鑒定藥敏儀（上海復星佰珞）進行菌種鑒定和18種藥敏判讀。

1.2.2 相應基因的擴增 提取大腸桿菌基因組DNA作為模板，分別使用以下引物進行擴增，并對擴增結果進行測序及同源性比較。AcrA：上游引物為 5′-GACGACAAACAGGCCCAACA-3′，下游引物為 5′-TTAAGACTTGGACTGTTCA-3′；qnrA[19]：上游引物為 5′-CCAGGATTTGAGTGACAGC-3′，下游引物為 5′-TCCCAAGGGTTCCAGCA-3′；TEM[20]：上游引物為 5′-GGGGATGAGTATTCAACATTTCC-3′，下游引物：5′-GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA-3′。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌藥敏結果分析

藥敏結果表明，30株雞源性致病大腸桿菌對18種抗生素的17種產生不同程度耐藥，其中，對β-內酰胺類藥物高度耐藥，耐藥率達70%，對FQs類藥物耐藥率為60%（表1）。

對多重耐藥進行統(tǒng)計，結果表明，30株大腸桿菌均表現(xiàn)多重耐藥。其中，7株菌耐4種藥，5株菌耐2種藥，耐6種藥和12種藥的菌各3株。每株菌平均耐藥6.5種，最少2種，最多14種（表2）。依據ELBLs判定方法，共計14株菌為ELBLs菌株。

表1 大腸桿菌對18種抗生素的藥敏試驗結果

表2 大腸桿菌多重耐藥性結果

對多重耐藥類型進行統(tǒng)計，山西各地采集到的30株雞源大腸桿菌中，有23種多重耐藥類型，其中，AMK-TZP-SAM-CZO和CIP-LVX的耐藥型各4株，其他類型的多重耐藥譜出現(xiàn)情況幾乎無重復（表3）。

表3 大腸桿菌耐藥譜型

2.2 多重耐藥相關基因分析

以大腸桿菌基因組為模板，對AcrA基因片段的擴增結果如圖1所示。

從電泳結果可以看到，所有菌株通過PCR均得到了AcrA基因片段，選取多重耐藥菌株的PCR結果進行膠回收并連接T載體、測序。測序結果在NCBI進行序列比對，同源性達99%。對序列的編碼蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白編碼沒有改變。由此可知，菌體中的AcrAB功能完整。

由圖2可知，30株雞源大腸桿菌中檢測到符合目的基因（約592 bp）的共計11株，通過與藥敏結果進行比對，擴增獲得qnrA基因的菌株均對FQs類藥物耐藥；而另有7株不具備qnrA基因的菌株也對FQs耐藥。在所有18株對FQs類耐藥的菌株中，僅有4株單純對FQs類耐藥，其余14株均不同程度對其他藥物也產生耐藥。

對TEM基因片段的擴增結果表明，30株雞源大腸桿菌中檢測到符合目的基因（約861 bp）的共計4株（圖3）。根據PCR結果和藥敏結果綜合分析，具有TEM基因的菌株均表現(xiàn)為ESBLs型。而14株ESBLs菌株中僅有4株TEM檢出陽性，占28.5%。

3 討論

本研究以30株雞源致病性大腸桿菌作為試驗組，對其進行藥敏試驗，結果表明，山西省雞源致病性大腸桿菌已對喹諾酮類、氨基糖苷類藥物產生高度耐藥性。其中，喹諾酮類藥物中，環(huán)丙沙星和左氟沙星耐藥率均為60%。選取與之耐藥有關的基因進行分析，菌體染色體中具有遺傳耐藥性的已達61%，這是由喹諾酮類藥物在長期的使用過程中導致菌體基因突變等原因造成的。

氨基糖甙類平均耐藥率已達到55%，該類藥物在生產實踐中已存在長期普遍性耐藥。遺傳耐藥性已較為廣泛。

而頭孢類藥物耐藥情況表現(xiàn)為，對第1代頭孢（頭孢唑林）的耐藥性較高，耐藥率達到70%；而對2，3，4代頭孢的耐藥率平均為26.6%。在對相關基因進行分析后發(fā)現(xiàn)，具有可遺傳性耐藥的僅占28.5%，其余大部分是由于用藥環(huán)境不當（如抗生素的長期使用、不規(guī)范使用等）激發(fā)菌體主動外排機制活躍而引起，這種情況在用藥環(huán)境改善后會逐步消除。

從山西省雞源致病性大腸桿菌耐藥情況來看，喹諾酮類和氨基糖甙類由于耐藥水平較高且具有較高遺傳性，因而在實際生產中建議不作為首選用藥。頭孢藥物中除一代頭孢外，均對菌體具有一定的藥物敏感性，且其中具有遺傳性耐藥的比率很低，可作為首選用藥推薦使用。

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