張榮華 ，王 曦 ，鄭彥偉 ，李武峰

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032；3.和順縣農(nóng)業(yè)委員會，山西 和順 032700）

黑山羊主要分布在云南、四川等海拔1 200～3 000 m的丘陵和山區(qū)地帶，而呂梁黑山羊是我國北方山區(qū)的優(yōu)良種質(zhì)資源之一，歷史悠久，地域性強[1]。該品種外形獨特、肉質(zhì)鮮美，對常年低溫、四季降雨量變化大的氣候環(huán)境和高低不平的地勢、植被稀疏的地理環(huán)境都有著良好的適應(yīng)能力。由于呂梁黑山羊?qū)偃馄そq毛兼用型山羊，具有較高的經(jīng)濟價值，再加上其抗寒、抗病、耐粗飼，故培育優(yōu)良品種及其推廣就顯得尤為重要。早在1983年，呂梁黑山羊被列入《山西省家畜家禽品種志》[2]。當(dāng)時，該品種占山西全省山羊總數(shù)的40.7%，而近些年來，雖然對家畜動物的育種、繁殖發(fā)展迅猛，但對該種質(zhì)資源的保護(hù)、選育和利用少之又少，更缺乏對其的研究，很多問題亟待解決。據(jù)2010年底統(tǒng)計，中心產(chǎn)區(qū)呂梁市黑山羊存欄數(shù)由從前的107萬只驟降至不足0.6萬只，瀕臨滅絕[3]。

成纖維細(xì)胞因其容易分離、培養(yǎng)、操作的特性，常常被當(dāng)作供體細(xì)胞進(jìn)行核移植，培育克隆動物。體細(xì)胞克隆是將動物體細(xì)胞移植到去核卵母細(xì)胞中，融合激活，體外培養(yǎng)發(fā)育成新的個體。自1996年第1只克隆羊多利誕生以來，利用成纖維細(xì)胞已經(jīng)成功克隆出梅山豬[4]、山羊[5]、和牛[6]等等。但是大多數(shù)克隆所用的成纖維細(xì)胞取自胎兒，而使用出生后個體可以簡化試驗步驟，避免傷害懷孕母畜。

本試驗旨在建立、完善呂梁黑山羊耳緣成纖維細(xì)胞培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步的克隆試驗提供供體細(xì)胞[7]。以3月齡的呂梁黑山羊耳緣組織為試驗材料，體外制備、分離、培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，對血清體積分?jǐn)?shù)因素進(jìn)行探究，使用活體檢測細(xì)胞數(shù)量，以求尋找最合適的條件，為進(jìn)一步研究呂梁黑山羊的克隆、基因轉(zhuǎn)染、構(gòu)建基因文庫等提供生物學(xué)材料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試羊只來自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所呂梁黑山羊克隆基地。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白酶（Serva公司）、DMEM（Gibco）、胎牛血清（FBS，Gibco）、碳酸氫鈉（Sigma）、注射用青霉素鈉、DMSO（Sigma）、兩性霉素 B（Blotapped）、注射用硫酸鏈霉素、PBS（1×PBS，pH 值 7.2～7.4，Solarbio）、生理鹽水、雙蒸水、新吉爾滅、酒精，均為國產(chǎn)試劑。

微量移液器（Eppenderf公司，10，100，200，1 000 μL 型）、高速低溫離心機（Sigma，2-16PK型）、CO2培養(yǎng)箱（Therm oF orma，3131型）、電子天平（METTLER TOLEDO，AL104-IC型）、體式顯微鏡（OLYMPUS，SZX10型）、恒溫板（OLYMPUS）、摩爾基因型超純水機（上海摩勒生物科技有限公司，MO6-063型）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，YXQ-LS-SⅡ型)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海聯(lián)進(jìn)醫(yī)療器械廠，101-2-BS-Ⅱ型）、電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司，DK-8D型）、超凈工作臺（蘇凈安泰公司）、超低溫冰箱（中科美菱公司）、CK40-32PH型倒置相差顯微鏡（OLYMPUS），CK41型熒光倒置相差顯微鏡（OLYMPUS），MP120型便攜式酸度計（Thermo）。

DMEM溶液：將10 gDMEM粉末溶于800 mL純水中，加3.7 gNaHCO3，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，定容至1 L。經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞培養(yǎng)液：（1）FBS體積分?jǐn)?shù)為0的培養(yǎng)液為 DMEM 29.3 mL＋15%（V/V）FBS 0 mL＋兩性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL；（2）FBS 體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)液為DMEM 27.8 mL＋15%（V/V）FBS1.5 mL＋兩性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL；（3）FBS 體積分?jǐn)?shù)為 10%的培養(yǎng)液為DMEM26.3 mL＋15%（V/V）FBS 3.0 mL＋兩性霉素300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL；（4）FBS 體積分?jǐn)?shù)為20%的培養(yǎng)液為DMEM 23.3 mL＋15%（V/V）FBS6.0 mL＋兩性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL；（5）FBS 體積分?jǐn)?shù)為 40%的培養(yǎng)液為DMEM 17.3 mL＋15%（V/V）FBS 12.0 mL＋兩性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL 。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 采集3只（1只公羊，2只母羊）3月齡呂梁黑山羊耳緣組織，除去耳緣羊毛，用75%酒精擦拭，碘伏消毒后再用酒精棉球脫碘。用采樣鉗取1 cm2左右大小的耳緣組織，置于加有PBS（含100 IU/mL青霉素＋100 IU/mL鏈霉素）的采樣管中，封口膜封口，記錄采集樣品的羊只耳號。將采樣管投入4～8℃保溫瓶中，旋緊瓶蓋，1 h內(nèi)運回實驗室。

1.3.2 成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 在超凈臺及實驗室紫外線消毒30 min，37℃孵育細(xì)胞培養(yǎng)液和PBS緩沖液2 h。

細(xì)胞制備：在超凈臺中將耳緣組織塊用75%酒精浸泡30 s。將樣本置入加有PBS的無菌培養(yǎng)皿中，刮除遺留毛根，去除軟骨組織，用PBS液沖洗10次；再用培養(yǎng)液浸泡2遍；將樣本移入35 mm培養(yǎng)皿中，剪碎（1 mm2左右），均勻分布在皿底，密度不宜過大；最后將培養(yǎng)皿倒置入38.5℃，5%（V/V）CO2和90%相對飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，待樣本組織塊貼壁。顯微鏡觀察，確定貼壁后每皿加入1 mL的FBS體積分?jǐn)?shù)為10%的培養(yǎng)液，重新放入培養(yǎng)箱[8]；組織塊培養(yǎng)6 h后，每皿加入2 mL的FBS體積分?jǐn)?shù)為10%的培養(yǎng)液；2 d后觀察有無污染，有無細(xì)胞遷移出。原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞貼壁、呈放射狀，待3～4 d后細(xì)胞匯合，呈長梭狀。

細(xì)胞換液：每2 d換一次培養(yǎng)皿中的10%FBS細(xì)胞培養(yǎng)液，每皿2 mL，培養(yǎng)液要提前孵育2 h。由于原代細(xì)胞生長緩慢，每2 d觀察一次有無細(xì)胞遷出。

傳代培養(yǎng)：待原代細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在無菌操作臺中，將培養(yǎng)皿中的廢液棄去，使用PBS清洗3遍，以去除殘留血清。然后每皿加入1 mL的胰蛋白酶消化液消化，置于38.5℃，5%（V/V）CO2和90%相對飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)1 min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，待約80%細(xì)胞變圓、漂浮后，每皿再加入2 mL加有血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。集中吹打組織塊周圍多次，待大部分細(xì)胞懸浮后，吸取上清液加入15 mL離心管，用PBS洗滌培養(yǎng)皿3次，將洗滌液加入離心管；1 000 r/min離心5 min，小心棄去上清液后，用200 mL培養(yǎng)液懸浮沉淀后加入培養(yǎng)皿中，用培養(yǎng)液洗滌離心管3次，加入培養(yǎng)皿使皿中液體混合均勻，顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)量。使用血球計數(shù)板和0.4%臺盼藍(lán)染液進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)到60%，并置于37℃，5%（V/V）CO2和90%相對飽和濕度培養(yǎng)箱中分皿繼續(xù)培養(yǎng)。操作過程在恒溫板上進(jìn)行。

傳代后每天觀察細(xì)胞的生長情況。大部分傳代細(xì)胞在12 h內(nèi)逐漸貼壁。此時，顯微鏡可明顯觀察到有絲分裂各期細(xì)胞的分裂相。同時，培養(yǎng)基中有少量懸浮細(xì)胞，這些細(xì)胞在傳代過程中受損而死亡（造成這種損傷的原因可能是機械損傷、胰蛋白酶消化等）。它們可在下次換液時一同棄去。細(xì)胞傳代后生長狀況良好，速度較原代要快，且具有典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 不同體積分?jǐn)?shù)FBS下培養(yǎng)成纖維細(xì)胞 取正處于對數(shù)期的第3代成纖維細(xì)胞，每皿中加入1 mL胰蛋白酶消化液消化，1～2 min后每皿加入2 mL培養(yǎng)液終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，然后分別以不同體積分?jǐn)?shù)（0，5%，10%，20%，40%）的FBS培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞板，通過0.4%臺盼藍(lán)染色和血球計數(shù)板控制每孔1.3×105個細(xì)胞。置于 37 ℃，5%（V/V）CO2和 90%相對飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 細(xì)胞計數(shù) 連續(xù)7 d在相同時間使用倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，拍照記錄，并進(jìn)行活體計數(shù)、處理（圖 1～3）。

活體計數(shù)：血球計數(shù)板和蓋玻片先用酒精清潔、干燥；然后將少量等體積的細(xì)胞懸液和0.4%臺盼藍(lán)染液混合均勻染色，靜置2～3 min；輕輕吹打混合液，吸取少量液體滴在蓋玻片一側(cè)，注樣量不要溢出蓋玻片且不宜帶氣泡；待液體進(jìn)入計數(shù)室時計數(shù)，死細(xì)胞為藍(lán)色，活細(xì)胞為無色透明。統(tǒng)計四角大方格中活細(xì)胞數(shù)，若細(xì)胞壓中線，計左和上方數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件（Duncan法）進(jìn)行差異顯著性檢驗。

其中，DT表示細(xì)胞倍增時間，t為培養(yǎng)時間，N0為首次記下的細(xì)胞數(shù)，Nt為t時間后的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

用胎牛血清體積分?jǐn)?shù)分別為0，5%，10%，20%，40%的培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的情況各不相同，所有試驗組細(xì)胞均在培養(yǎng)6 h后貼壁，形態(tài)良好，成梭形，透亮折光度較好。其中，10%試驗組細(xì)胞能看到細(xì)胞中心的細(xì)胞核；40%試驗組細(xì)胞最早出現(xiàn)大量細(xì)胞形態(tài)不完整、細(xì)胞懸浮等現(xiàn)象；每組當(dāng)培養(yǎng)皿底鋪滿80%時，發(fā)生接觸抑制，生長趨勢緩慢[12]。

2.2 臺盼藍(lán)染色檢測活細(xì)胞數(shù)目結(jié)果

每組差別較大，根據(jù)FBS體積分?jǐn)?shù)的不同，以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，耳緣成纖維細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)繪制曲線（圖4）。由圖4可知，0培養(yǎng)組細(xì)胞生長緩慢，數(shù)量少，細(xì)胞狀態(tài)也沒有明顯變化。5%，10%和20%血清體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，在3～5 d時達(dá)到對數(shù)生長期，生長速度較快，平均細(xì)胞數(shù)目多，其中，生長趨勢最好的是10%試驗組，活細(xì)胞最多，細(xì)胞生長曲線呈S形；其次是5%試驗組，細(xì)胞狀態(tài)良好，但5 d后細(xì)胞增長沒有10%試驗組的細(xì)胞迅速；5 d后，這3組培養(yǎng)組的細(xì)胞生長趨勢變緩，最為明顯的是20%培養(yǎng)組，死亡細(xì)胞數(shù)目增多，可能與細(xì)胞膜受損有關(guān)[13]。而40%培養(yǎng)組由于血清濃度過高，細(xì)胞數(shù)量的增加幾乎處于停滯狀態(tài)，維持一段時間后從第3天就開始衰退，且5～7 d比3～5 d衰退迅速，在5組中細(xì)胞數(shù)量最少，長勢最差。綜上所述，培養(yǎng)液中FBS的體積分?jǐn)?shù)對成纖維細(xì)胞生長影響較明顯。FBS體積分?jǐn)?shù)為5%，10%，20%試驗組對細(xì)胞生長狀況的影響差異不顯著（P＞0.05），其中，10%培養(yǎng)組對細(xì)胞生長最有利；但三者與0，40%試驗組間差異顯著（P＜0.05），且0與40%試驗組間差異也顯著（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

哺乳動物克隆是近年來生物領(lǐng)域的研究熱點[14]?？寺〖夹g(shù)不僅可用于改良優(yōu)化品種、保護(hù)瀕危動植物，也可用于治療疾病、針對性生產(chǎn)生物反應(yīng)器等[15]。耳緣成纖維細(xì)胞作克隆供體細(xì)胞具有一定的優(yōu)勢，它易分離、易培養(yǎng)，同時增殖能力較強，即使多次傳代后細(xì)胞狀態(tài)和增殖能力仍良好。而血清是培養(yǎng)供體細(xì)胞最有效的生物液體之一[16]。其中的生長因子、激素等物質(zhì)對成纖維細(xì)胞的生長具有重要作用。但血清的成分復(fù)雜，也包含很多有害因子，如血清細(xì)胞毒作用等[17]。所以，血清體積分?jǐn)?shù)對培養(yǎng)成纖維細(xì)胞至關(guān)重要。

本試驗發(fā)現(xiàn)，不同體積分?jǐn)?shù)血清的培養(yǎng)液對黑山羊耳緣成纖維細(xì)胞有一定影響。0血清體積分?jǐn)?shù)組，細(xì)胞由于無血清，營養(yǎng)低，所以數(shù)量變化??；5%血清體積分?jǐn)?shù)組細(xì)胞數(shù)量比0多，狀態(tài)好，可增殖，但仍比10%，20%組慢；10%和20%血清體積分?jǐn)?shù)組的細(xì)胞狀態(tài)較好，數(shù)量較多，但20%組后期可能有膜受損現(xiàn)象，衰亡的比較多。由臺盼藍(lán)染色可知，10%試驗組是5組中活細(xì)胞數(shù)目最多、生長狀態(tài)最好的，因此，其是體外成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的最適血清體積分?jǐn)?shù)。而40%血清體積分?jǐn)?shù)組的細(xì)胞在后期數(shù)量下降劇烈，說明血清濃度過高不適宜成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)。綜上所述，培養(yǎng)液中胎牛血清體積分?jǐn)?shù)直接影響到后續(xù)以其為供體細(xì)胞克隆呂梁黑山羊的試驗結(jié)果，所以在后續(xù)的試驗中決定選用10%血清體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)液培養(yǎng)供體細(xì)胞。

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