張昦昉，王璐茜，盧海霞，姚春濤，王鈞

（吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

引言

納米銀抗菌機(jī)制尚不明確，有研究表明：納米銀能夠使酶失活，干擾呼吸代謝；能夠增加細(xì)胞膜的通透性[1]；可損傷細(xì)菌的DNA[2]。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法來(lái)評(píng)價(jià)生物材料和醫(yī)療器械或浸提液潛在的細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性試驗(yàn)是生物安全評(píng)價(jià)體系中重要的檢測(cè)指標(biāo)之一。本研究采用MTT 法考察樣品的體外細(xì)胞毒性，為納米銀抗菌產(chǎn)品的體外安全性評(píng)價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 L929 細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；DMEM 高糖培養(yǎng)基，HyClone 公司；胎牛血清，GIBCO；MTT，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器 超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo；酶標(biāo)儀，BIO-RAD。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)基 L929 細(xì)胞，采用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.2 樣品配制 采用1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)、6 號(hào)樣品，其中1 號(hào)、4 號(hào)、6 號(hào)樣品為液體，2 號(hào)、3 號(hào)樣品為浸膏。1 號(hào)、4 號(hào)、6 號(hào)樣品的配制：取1 號(hào)、4 號(hào)、6 號(hào)樣品，0.25μm 濾膜過(guò)濾除菌，即得原液。取適量原液，加入含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，稀釋至1/5原液、1/10 原液、1/30 原液、1/100 原液、1/300 原液、1/1000 原液。2 號(hào)、3 號(hào)樣品的配制：稱(chēng)取適量2 號(hào)、3號(hào)樣品，加入含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，制得濃度為0.2 mg/ml 的原液，0.25μm 濾膜過(guò)濾除菌。取適量原液，加入含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，稀釋至1/5 原液、1/10 原液、1/30 原液、1/100 原液、1/300 原液、1/1000 原液。

表1 受試物對(duì)體外細(xì)胞相對(duì)增值率和細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)的影響（，d）

表1 受試物對(duì)體外細(xì)胞相對(duì)增值率和細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)的影響（，d）

2.3 MTT 試驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的L929 細(xì)胞，消化，調(diào)整細(xì)胞密度，均勻接種到96 孔板內(nèi)。24 h 后，倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，吸棄培養(yǎng)液，加入受試物100μl，陰性對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基100μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h 后，每孔加入20μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄孔內(nèi)液，加入DMSO150μl，震蕩10 min，500 nm處測(cè)定吸光度值。

3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用細(xì)胞相對(duì)增值率（relative growth rate,RGR）評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性：

0 級(jí)為RGR ≥100%，1 級(jí)為80%-99%，2 級(jí)為50%-79%，3 級(jí)為30%-49%，4 級(jí)為0-29%

4 結(jié)果

4.1 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下放大200 倍觀(guān)察可見(jiàn)，陰性對(duì)照孔內(nèi)細(xì)胞形態(tài)多成梭形或多邊形，疏松貼壁，無(wú)胞漿內(nèi)顆粒。在不同的受試物中，細(xì)胞毒性分為2 級(jí)的孔內(nèi)細(xì)胞多數(shù)呈梭形或多邊形，部分細(xì)胞呈圓形，無(wú)胞漿內(nèi)顆粒，明顯可見(jiàn)細(xì)胞溶解和細(xì)胞間空區(qū)；細(xì)胞毒性分級(jí)為3 級(jí)的孔內(nèi)細(xì)胞多數(shù)變圓漂浮、脆核固縮、胞內(nèi)形成許多空泡，細(xì)胞溶解；細(xì)胞毒性分級(jí)為4 級(jí)的孔內(nèi)細(xì)胞大多數(shù)呈圓形或溶解，細(xì)胞層幾乎完全破壞。

4.2 受試物對(duì)體外細(xì)胞相對(duì)增值率和細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)的影響5 種受試物的體外細(xì)胞相對(duì)增值率和細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，受試物不同濃度對(duì)細(xì)胞相對(duì)增值率差異較大，當(dāng)稀釋比為1:100 時(shí)，細(xì)胞毒性均顯著降低。

5 結(jié)論

納米銀具有較廣的抗菌譜，對(duì)大腸桿菌、淋球菌、沙眼衣原體等均都有抑制和殺滅作用，且不易產(chǎn)生耐藥性。納米銀的抗菌特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，但其安全性有待于深入研究[3]。本研究表明，受試物不同濃度對(duì)細(xì)胞相對(duì)增值率差異較大，當(dāng)稀釋比為1:100 時(shí)，細(xì)胞毒性均顯著降低。