鄧志偉,王瑩瑩,張永杰,王松廷,楊生玉

(河南大學生命科學學院生物工程研究所,河南開封 475004)

伴隨科技的進步和全球人口的持續(xù)增長,塑料被廣泛用于日常生活及工業(yè)的各個方面。然而大部分的傳統(tǒng)塑料,如Polyethylene、Polypropylene、Polystyrene等都是不可降解的塑料，它們的使用給環(huán)境造成了嚴重的污染。為了減少白色污染問題,可降解的生物塑料應運而生。PHB具備較好的生物可降解性及塑料熱加工性,其分解產(chǎn)物能夠被環(huán)境中的微生物徹底利用,對自然界沒有任何污染。因此,PHB可以制成可降解垃圾袋、購物袋、一次性餐盒等,從而減少各種各樣的廢棄塑料對環(huán)境造成的嚴重污染。

聚羥基丁酸(PHB)是一種胞內(nèi)存儲的生物可降解材料,是微生物在培養(yǎng)基中碳源和氮源比例失衡的條件下而產(chǎn)生的,作為碳源和能源而儲存于細胞內(nèi)的物質(zhì)[1]。PHB是微生物菌體同化作用的初級代謝產(chǎn)物,它可以維持滲透壓的平衡,與動物細胞和植物細胞中的糖元及淀粉一樣,是微生物內(nèi)的儲能物質(zhì)[2-3]。在自然條件下細菌菌體內(nèi)PHB含量比較低,一般為1%～3%。但在培養(yǎng)基中碳源含量過量并且氮源缺乏的情況下,細菌菌體內(nèi)的PHB含量可以達到菌體生物量的70%～80%,因此通過控制發(fā)酵液中碳氮的比例來調(diào)節(jié)微生物菌體內(nèi)PHB的產(chǎn)量,同時這也給分批流加一定的碳源來提高PHB的產(chǎn)量提供了理論基礎。

國外關于PHB的探究起步較早,自20世紀70年代后,由于石油危機和環(huán)保運動,PHB的商業(yè)化生產(chǎn)受到許多科研工作者的重視。其中英國帝國化學公司是最早實現(xiàn)PHB工廠化生產(chǎn)的企業(yè),其生產(chǎn)的PHBV(3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的共聚物),命名為Biopol,此外,美國、日本、加拿大等國家也已經(jīng)實現(xiàn)了PHB的小規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[4-5]。Sathiyanarayanan等采用統(tǒng)計學方法優(yōu)化BacillussubtilisMSBN 17菌株的發(fā)酵條件,發(fā)酵40 h后PHB含量達到19.08 g/L[6]。Moreno等分別采用搖瓶和生物反應器優(yōu)化培養(yǎng)Bacillusmegaterium,其PHB含量分別增加48%和314%[7]。

盡管我國對PHB的研究起步較晚,但發(fā)展迅速[8]。魏國清等利用E.coli工程菌在5 L生物反應器中培養(yǎng)32 h,PHB濃度達到8.24 g/L,且PHB含量占細胞干重的84.6%[9]。但是胞內(nèi)PHB的提取純化工藝繁瑣,造成它的成本大概為化學合成塑料的幾倍,甚至十幾倍,所以提高PHB的產(chǎn)量,減少生產(chǎn)成本成為國內(nèi)外業(yè)界急需解決的難題。

采用分批補料培養(yǎng)的方法提高PHB的產(chǎn)量是近些年來研究的一個熱點。分批補料培養(yǎng)是介于分批培養(yǎng)及連續(xù)培養(yǎng)之間的一種發(fā)酵培養(yǎng)技術。同分批補料發(fā)酵相比,分批補料培養(yǎng)[5]可以有效的降低底物濃度從而消除底物抑制、降低發(fā)酵液的粘度、增大體系初始溶氧濃度來提高底物利用率,從而縮短發(fā)酵時間,提高生產(chǎn)效率[10-11]。但是在已報道的研究工作中,PHB的生產(chǎn)得率一般低于0.25[12]。許懿等[13]利用真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16菌株生產(chǎn)PHB,細胞干重達到16.1 g/L,PHB的質(zhì)量濃度達到7.9 g/L。本文首先研究了不控制pH及控制pH時發(fā)酵過程中相關參數(shù)的變化情況對發(fā)酵結(jié)果的影響,接著研究了pH作為補料的控制信號,采用pH反饋的發(fā)酵工藝來提高羅氏產(chǎn)堿桿菌的生物量和PHB的產(chǎn)量以及生產(chǎn)得率的方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菌株Rochealcaligenessp PP25 由本實驗實從污水中分離獲得[14]；PHB標準品 色譜級,Sigma公司;甘油、(NH4)2SO4、MgSO4、Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、檸檬酸、NaOH、HCl、濃H2SO4均為分析純。

BIOTECH-5BG-7000A自動發(fā)酵罐 上海保興生物設備工程有限公司;ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;1515型高效液相色譜儀 美國Waters公司;5810R高速冷凍離心機 Eppendorf;GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

一級種子培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏 30,蛋白胨 10,NaCl 5,瓊脂 20,pH7.5。

二級種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 10,酵母粉 2,CaCl20.1,NaCl 1,K2HPO40.5,Na2HPO4·12H2O 0.6,pH7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20,酵母粉 10,CaCl20.12,K2HPO42,Na2HPO4·12H2O 10,MgSO40.5,檸檬酸鐵 0.1。

補料培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 400,酵母粉 100。

以上培養(yǎng)基在115 ℃下滅菌30 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子的培養(yǎng) 挑取斜面上的菌落接入一級種子培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h,然后吸取一級種子培養(yǎng)液以6%的接種量接入二級種子培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)10 h,接著吸取二級種子培養(yǎng)液以6%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.3.2 不控制pH分批培養(yǎng) 將培養(yǎng)10 h的二級種子培養(yǎng)液按6%的接種量接入5 L發(fā)酵罐(裝液量3 L)中,400 r/min、30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h,pH不進行控制。研究在pH不控制的狀態(tài)下的發(fā)酵過程。

1.3.3 控制不同pH的分批培養(yǎng) 不控制pH的分批發(fā)酵過程中,由于pH的降低,對菌體生長產(chǎn)生一定的抑制作用,因此在實驗過程中利用6 mol/L的HCl和6 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH,使得pH分別控制在6.2～6.4、6.7～6.9、7.2～7.4三個范圍,其他培養(yǎng)條件與1.3.2相同,考察了不同的pH范圍對發(fā)酵結(jié)果的影響。

1.3.4 pH反饋的補料分批培養(yǎng) pH反饋補料前期先進行分批培養(yǎng),轉(zhuǎn)速、溫度同1.3.2,前期pH通過流加酸堿控制在6.8。pH反饋補料控制階段,pH控制與補料關聯(lián)的參數(shù)設置為反向關聯(lián),當pH>6.8時啟動補料,補料模式為加2 s、停10 s。隨著發(fā)酵過程中pH的降低,泵入6 mol/L的NaOH使發(fā)酵培養(yǎng)過程的pH保持在6.7～6.9范圍內(nèi)。

1.4 指標的測定

1.4.1 菌體生物量的測定 取發(fā)酵液10 mL,于離心機中8000 r/min離心10 min,棄上清,60 ℃干燥至恒重,稱量[15]。

1.4.2 殘?zhí)堑臏y定 發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y定采用DNS法[16]。首先是標準曲線的繪制,分別取葡萄糖(mg/mL)0、0.2、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于25 mL比色管中,用蒸餾水補充至2 mL,加入DNS試劑1.5 mL,沸水浴加熱5 min,冷卻至室溫,用蒸餾水定容至25 mL,混勻在540 nm波長下測定吸光度。將發(fā)酵液中的殘?zhí)沁M行稀釋,糖濃度在0.1-1.2 mg/mL,取稀釋后的發(fā)酵液1.0 mL于25 mL比色管中,加入DNS試劑1.5 mL,沸水加熱5 min,冷卻至室溫后定容至25 mL,在540 nm波長下測定吸光度,從標準曲線查出葡萄糖濃度,求出發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮?。DNS標準曲線方程為Y=0.3995X-0.0307,R2=0.9996,其中X為葡萄糖濃度(mg/mL),Y為吸光值。

1.4.3 PHB濃度的測定 PHB含量測定采用高效液相色譜法[17]。精確稱量PHB樣品200 mg,放到比色管中,用硫酸進行消化處理,以超純水稀釋1000倍,然后使用0.45 μm的微孔濾膜過濾備用,最后用高效液相色譜法進行檢測。精確稱量200 mg PHB的標準品,放到比色管中,加入5 mmol/L硫酸溶液進行處理,用超純水分別稀釋為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的PHB溶液,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,橫坐標是PHB的濃度,縱坐標是峰面積。PHB的標準曲線方程為:Y=211096.5X-47170.5,R2=0.99946。X是PHB的濃度,mg/L,Y是峰面積。色譜柱:BioRad公司Aminex HPX-87H柱,(300 mm x 7.8 mm,9 μm);柱溫:50 ℃;流動相:5 mmol/L硫酸溶液;初始流速:0.5 mL/min,進樣量20 μL,紫外檢測器波長210 nm。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0進行作圖和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 分批培養(yǎng)

2.1.1 不控制pH的分批發(fā)酵過程 葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑形成丙酮酸進而形成乙酰輔酶A,乙酰輔酶A在β-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A、PHB合成酶等酶類的作用下合成PHB,因此在該過程下會受到pH的影響,所以在室驗中我們首先研究了不控制pH時發(fā)酵過程的各種參數(shù)對PHB分批發(fā)酵結(jié)果的影響,結(jié)果見圖1。從圖1中我們可以看出隨著發(fā)酵時間的增加,在發(fā)酵28 h時底物接近于消耗完全,PHB的濃度達到最高,PHB的濃度最大達到3.97 g/L。而此時發(fā)酵液的pH也從最初的7迅速降到了最低值,再隨著發(fā)酵時間的增加,底物的消耗速率迅速下降,同時產(chǎn)物PHB的產(chǎn)量開始下降，說明不控制pH的條件下發(fā)酵液的pH迅速下降,并且相對酸性條件下不利于產(chǎn)物的產(chǎn)生和儲存。在發(fā)酵24 h時菌體生物量達到最大6.55 g/L,然而隨著pH的下降,菌體的干重并未發(fā)生太大的變化,說明發(fā)酵過程pH的波動對菌體的生長影響較小。然而pH的波動對產(chǎn)物PHB的產(chǎn)量具有一定的影響,而且隨著碳源的耗盡,PHB也可以作為能源物質(zhì)被利用,因此為了防止PHB在碳源耗盡時被菌體利用,選擇pH上升點(發(fā)酵28 h)作為發(fā)酵終點,同時該點也可作為補料點,補充一定量的碳源和控制發(fā)酵過程的pH來防止產(chǎn)物PHB濃度的下降。

圖1 在分批培養(yǎng)過程中相關參數(shù)的 時間曲線(pH不進行控制)Fig.1 Time course of correlation parameter during the batch culture (pH-uncontrolled batch culture)

2.1.2 控制pH的分批培養(yǎng) PHB的生產(chǎn)過程是由酶一步步催化獲得,不同的pH對酶的活性以及菌體的生長具有一定的影響,根據(jù)我們的實驗室前期工作(數(shù)據(jù)未展示),選擇了將pH控制在6.2～6.4、6.7～6.9、7.2～7.4三個范圍來研究pH控制對PHB分批發(fā)酵結(jié)果的影響,結(jié)果見圖2。由圖2可得,與不控制pH的分批發(fā)酵相比,當pH控制在6.2～6.4時,菌體生物量及pH的產(chǎn)量分別提高了7.63%和3.63%;當pH控制在6.7～6.9時,菌體生物量及pH的產(chǎn)量分別提高了18.63%和12.52%;當pH控制在7.2～7.4時,菌體生物量及PHB濃度分別降低了24.76%和31.71%。由此圖和以上數(shù)據(jù)可以看出當pH控制在6.7～6.9的范圍時,不僅利于菌體自身的生長而且有利于PHB的合成,說明在pH為6.7～6.9的范圍下有關菌體生長和PHB合成的酶處于較高的活性狀態(tài)下,因此選擇將發(fā)酵過程的pH控制在6.7～6.9。

圖2 在分批培養(yǎng)過程中相關參數(shù)的時間曲線(pH進行控制)Fig.2 Time course of correlation parameter during the batch culture(pH-controlled batch culture)注:A：pH為6.2～6.4;B：pH為6.7～6.9;C：pH為7.2～7.4。

2.2 pH反饋補料分批培養(yǎng)

利用酸堿來調(diào)節(jié)pH的分批培養(yǎng),可以使發(fā)酵過程中pH保持在一個相對較穩(wěn)定的范圍,從而使得菌體和產(chǎn)物的形成都優(yōu)于pH不控制的分批發(fā)酵培養(yǎng)過程。但由于發(fā)酵培養(yǎng)(pH控制在6.7～6.9)進行到8～12 h之后,發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖基本耗盡,進而在之后的發(fā)酵過程中菌體生物量的形成緩慢增加,同時產(chǎn)物PHB會被當成碳源利用,使得產(chǎn)物的產(chǎn)量下降。因此為了提高菌體生物量及PHB的產(chǎn)量,實驗中選擇在發(fā)酵8 h后進行補料,并同時對補料的流加方式進行了優(yōu)化。

2.2.1 流加模式優(yōu)化 在pH控制與補料相關聯(lián)的補料分批培養(yǎng)過程中,通過反向關聯(lián)的方式,以pH為信號來流加葡萄糖和酵母浸粉混合液,即當pH大于6.9時啟動補料,反之停止補料。流加的碳氮混合液的量與控制模式有關。不同流加模式發(fā)酵過程的相關參數(shù)的影響結(jié)果見圖3。

圖3 pH反饋補料分批培養(yǎng)過程中相關參數(shù)的變化曲線Fig.3 Time course of correlation parameter during pH feedback fed batch culture

補料前的培養(yǎng)過程,通過流加酸堿使pH保持在6.7～6.9的范圍內(nèi)。圖3A流加模式為加2 s，停10 s,補料分批培養(yǎng)過程中,在發(fā)酵開始階段,發(fā)酵液的pH降低,蠕動泵自動加入2 mol/L的NaOH溶液使發(fā)酵過程中的pH維持在6.7～6.9,當葡萄糖消耗殆盡之后由于氨基酸的脫氨基作用使pH增加,當pH高于6.9時,補料泵自動加入葡萄糖和酵母浸粉混合溶液;圖3B流加模式為加2 s、停20 s,pH控制范圍為6.7～6.9的pH反饋補料分批培養(yǎng)過程。2種補料模式的分批補料培養(yǎng)過程的實驗結(jié)果見表1。

表1 2種補料分批培養(yǎng)過程的實驗結(jié)果Table 1 The experiment results in the two kinds of fed-batch culture

注:A、B表示不同的補料分批培養(yǎng)過程。

圖3和表1的結(jié)果表明,pH反饋控制流加模式的變化對補料過程有明顯的影響。圖3、表1中的A流加模式,由于葡萄糖和酵母浸粉混合液的流加速度過快,導致發(fā)酵液中的葡萄糖質(zhì)量濃度快速上升。過高的葡萄糖質(zhì)量濃度抑制菌體的生長,最終延長了發(fā)酵的周期。B流加模式為葡萄糖的分解利用提供足夠的時間,使發(fā)酵液的pH能夠在6.87～6.92范圍內(nèi)波動,從而避免了因為補料過快造成的葡萄糖濃度快速增加,抑制菌體生長現(xiàn)象的發(fā)生,延長了菌體的對數(shù)生長期,提高了菌體生物量及PHB的產(chǎn)量。由圖3可得,B流加模式發(fā)酵48 h即可使菌體生物量及PHB的產(chǎn)量達到最大，分別為22.14和14.41 g/L,而A流加模式發(fā)酵64 h才能使菌體生物量及PHB濃度達到最大,分別為19.69和13.717 g/L。與A流加模式相比，B的流加模式不僅可以縮短發(fā)酵時間,減少生產(chǎn)成本,同時菌體生物量及PHB濃度分別提高了12.44%和5.07%。

2.2.2 驗證實驗 按照上述優(yōu)化后及優(yōu)化前的流加模式進行重復實驗,發(fā)酵48 h,共做3個平行,結(jié)果見圖4。由圖4可得,優(yōu)化后的補料模式比優(yōu)化前的補料模式的菌體生物量及PHB濃度分別提高了35.5%和31.94%。

圖4 優(yōu)化前后對比Fig.4 The comparison of before and after optimization

3 結(jié)論

本文利用羅氏產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵生產(chǎn)PHB的過程中pH的變化情況,研究不同的pH范圍以及不同的pH反饋調(diào)節(jié)補料的流加方式對發(fā)酵結(jié)果的影響。通過不控制pH及控制pH的分批發(fā)酵過程中的菌體生物量、PHB濃度及殘?zhí)堑淖兓闆r的研究得出,當pH不進行控制時發(fā)酵液的pH迅速下降到不利于菌體生產(chǎn)和產(chǎn)物產(chǎn)生的狀態(tài)。同時控制pH在不同范圍的研究表明，羅氏產(chǎn)堿桿菌在微酸性的條件下生長最快，且有利于PHB的合成。當pH控制在6.7～6.9時,菌體生物量及pH的產(chǎn)量比不控制pH時分別提高了18.63%和12.52%。

本文采用不同的pH反饋補料工藝,發(fā)酵生產(chǎn)PHB,最終得出最佳補料工藝參數(shù)為加2 s停20 s的模式,此時菌體生物量和PHB濃度分別為22.52 g/L和13.61 g/L，胞內(nèi)的PHB含量達到60.44%。

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