張林松 徐衛(wèi)東 石繼偉 李 靜 張逸帆 高建花 趙 敏

（1.鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鎮(zhèn)江212000； 2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

酗酒的主要后果是酒精性肝損傷（ALD），它是慢性肝病的病因之一。ALD的早期表現(xiàn)主要為酒精性脂肪肝，常常繼發(fā)更嚴(yán)重的酒精性肝硬化[1]。至今，對此病仍缺乏有針對性的治療用藥。葛根是豆科多年生落葉藤本植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，主要含異黃酮類、三萜皂苷類、香豆素類等多種成分，但以葛根素的含量為最高[2]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗心律失常、降壓、調(diào)節(jié)免疫、解酒等廣泛的藥理作用[3]。而葛根多肽鮮有人關(guān)注。本研究制作小鼠ALD模型，觀察葛根提取物葛根素與葛根多肽對ALD模型小鼠的治療作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級昆明種小鼠（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：201703331），雌雄各半，體重18～24g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心培育；鼠飼料、墊料、鼠籠及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)用鼠置于（22±2）℃、每日光照時(shí)長約12h的動(dòng)物籠中，可自由采食、飲水。

1.2 藥物與試劑 葛根（亳州市佰世信中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：廣西）；堿性蛋白酶（Alcalase，2.4L，丹麥諾維信有限公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）測定試劑盒（南京市建成生物工程研究所）；白酒（紅星二鍋頭，56°，北京紅星股份有限公司）；水飛薊賓葡甲胺溶液（原料購自江蘇中興藥業(yè)有限公司，加水配成5mg/mL溶液）；葛根素溶液（原料購自江蘇天晟藥業(yè)有限公司，加水配成5mg/mL溶液）。

1.3 儀器 MD SpectraMax190自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國MD公司）；U410超低溫冰箱（三洋電器集團(tuán)）；ALPL-2LD冷凍干燥機(jī)（博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；pHS-3C精密pH/mV計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）；UV-7504單光束紫外-可見分光光度計(jì)（日本，島津）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 葛根多肽溶液的制備 將葛根飲片置烘箱中60℃干燥24h，冷卻后粉碎，過四十目篩，置干燥器中保存?zhèn)溆?。稱取2kg葛根粉末置于容器中，加入50mmol/L pH=9的Tris-HCl緩沖液20000mL，充 分?jǐn)嚢?，然后?0℃水浴提取2h并浸泡過夜；取提取液5000r/min離心10min，上清液抽濾，合并抽濾液，用濃鹽酸調(diào)pH至3，靜置2h，再5000r/min離心10min，棄去上清液，合并沉淀，置-70℃環(huán)境下冷凍48h，真空冷凍干燥，即得葛根蛋白粉末，保存于干燥器中備用。取葛根蛋白粉末用無水乙醇洗凈后，自然干燥備用。將上述葛根蛋白粉25g置于250mL燒杯中，加入用0.5mol/L鹽酸或0.5mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至9.0的硼酸鈉緩沖溶液100mL，攪勻，置于50℃水浴鍋中靜置20min使蛋白充分溶解，加入4g堿性蛋白酶（酶活力：3500U/g），再放入水浴鍋（溫度為61℃）中反應(yīng)2h，反應(yīng)過程中使用0.1mol/L氫氧化鈉維持pH不變。反應(yīng)完成后，沸水浴10min以滅活堿性蛋白酶，水浴降至室溫，加入15%三氯乙酸100mL，攪勻，并用0.5mol/L鹽酸或0.5mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，靜置半小時(shí)，4000r/min離心10min，取上清液，即得5mg/mL葛根多肽溶液。

2.2 造模、給藥與取材 取小鼠90只，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組（水飛薊賓葡甲胺，0.5mg/kg）和葛根素低、中、高劑量組（0.25、0.5、1.5mg/kg）以及葛根多肽低、中、高劑量組（0.25、0.5、1.5mg/kg），每組10只。除正常組外，其余各組小鼠模仿人類飲酒-發(fā)病-治療-再飲酒的過程[4]：每日1次連續(xù)4d灌胃白酒（0.12mL/10g），建立肝損傷模型；停酒2d后各給藥組連續(xù)5d給予相應(yīng)劑量的藥品，每日1次，灌胃；第12天，再次給酒（0.12mL/10g）。次日，乙醚麻醉無痛取血，3000r/min離心取血清，用生化試劑盒檢測；處死小鼠，取出肝臟，用PBS漂洗后，將肝樣品去除膽囊，凍存于生理鹽水中，以備進(jìn)行損傷評估。

2.3 小鼠血清ALT、AST、CHOL、HDL、LDL檢測 按照試劑盒說明，采用酶標(biāo)儀檢測和紫外分光光度計(jì)法測定小鼠血清ALT、AST、CHOL、HDL、LDL含 量，檢測結(jié)果以mmol/L表示。

2.4 肝組織評分方法 采用5分制，按照損傷程度將鼠肝大葉分為五個(gè)等級進(jìn)行評分[5]。0分：鼠肝腫脹、蒼白，出現(xiàn)大量白色壞死點(diǎn)；1分：鼠肝腫脹，出現(xiàn)一定白色壞死點(diǎn)；2分：鼠肝出現(xiàn)少量白色壞死點(diǎn)；3分：鼠肝無明顯壞死點(diǎn)，但表面不光滑；4分：鼠肝表面大部分光滑，但尚有少量粗糙帶；5分：鼠肝紅潤，表面光滑。

表1 各組小鼠血清中ALT、AST、CHOL、HDL、LDL的含量變化（±s）

表1 各組小鼠血清中ALT、AST、CHOL、HDL、LDL的含量變化（±s）

注： 與正常組比較，***P＜0.001 ；與模型組比較，#P＜0.05，###P＜0.001 ；與陽性對照組比較，△P＜0.05。

正常組 10 0.40±0.25 1.07±0.66 2.38±0.74 1.71±0.55 0.11±0.04模型組 10 4.03±0.72*** 11.24±1.14*** 5.83±0.55*** 1.92±1.03 0.15±0.06陽性對照組 10 0.50 1.12±0.27### 2.90±0.61### 2.77±0.71### 1.51±0.62 0.16±0.06葛根素組低劑量組 10 0.25 1.72±0.39###△ 5.09±0.81###△ 3.23±0.61### 2.79±1.54# 0.08±0.03#葛根素組中劑量組 10 0.50 1.23±0.40### 3.71±1.25### 2.59±0.24### 2.64±0.56# 0.15±0.03葛根素組高劑量組 10 1.50 0.49±0.26###△ 1.34±0.73###△ 1.77±0.18###△ 2.41±0.91# 0.09±0.02#葛根多肽低劑量組 10 0.25 1.38±0.14### 4.42±0.84### 3.33±0.62### 2.25±0.69 0.11±0.03葛根多肽中劑量組 10 0.50 0.97±0.19### 2.59±0.44### 3.46±0.56### 2.66±0.71 0.14±0.06葛根多肽高劑量組 10 1.50 0.33±0.21###△ 0.85±0.51###△ 3.41±0.47### 2.11±0.86 0.17±0.04

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠血清ALT、AST、CHOL、HDL、LDL含量比較 見表1。與正常組比較，模型組小鼠ALT、AST、CHOL含量顯著增加（P＜0.001），HDL、LDL含量變化不顯著（P＞0.05）。與模型組比較，水飛薊賓葡甲胺和葛根素、葛根多肽各劑量均能顯著降低模型小鼠血清ALT、AST、CHOL含量（P＜0.001），葛根素各劑量能顯著提高HDL含量（P＜0.05），葛根素低、高劑量能顯著降低LDL含量（P＜0.05）。高劑量葛根素和葛根多肽降低ALT、AST含量和高劑量葛根素降低CHOL含量效果與陽性藥物相比更加顯著（P＜0.05）。

3.2 各組小鼠肝組織損傷評分比較 正常組小鼠肝臟組織紅潤，表面光滑；模型組小鼠肝臟組織腫脹、蒼白，出現(xiàn)大量白色壞死點(diǎn)；陽性對照組小鼠肝臟組織表面大部分光滑，無明顯壞死點(diǎn)；葛根素組和葛根多肽各劑量組小鼠肝臟組織損傷均有不同程度的減輕。模型組小鼠肝臟組織損傷評分明顯低于正常組（P＜0.001），各給藥組評分均明顯高于模型組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），見表2。

4 討論

酒精性肝損傷的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要為機(jī)體反復(fù)多次過量攝入酒精，酒精在體內(nèi)蓄積后，可能引起氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、代謝、營養(yǎng)紊亂等一系列復(fù)雜反應(yīng)，進(jìn)而引起肝組織中甘油三酯含量聚積，膽固醇合成加強(qiáng)，并引起相應(yīng)載脂蛋白含量的改變，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞功能損傷[6-7]。酒精性肝臟脂肪變性及相關(guān)血清指標(biāo)改變是酒精性肝損傷的早期表現(xiàn)[8]。

水飛薊賓葡甲胺作為臨床上常用的治療酒精性肝損傷的藥物，主要通過抗自由基活性，清除活性氧和對抗脂質(zhì)過氧化，抑制一氧化氮的產(chǎn)生，降低磷脂酶活性，保護(hù)肝細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)、再生，調(diào)節(jié)免疫等發(fā)揮作用[9]。

臨床常用血清學(xué)指標(biāo)ALT、AST主要反映肝細(xì)胞損傷程度[10-11]，其數(shù)值與肝細(xì)胞受損程度成正比。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素、葛根多肽均可在一定程度上降低由酒精導(dǎo)致的ALT、AST水平升高，高劑量的效果甚至優(yōu)于陽性對照藥水飛薊賓葡甲胺，說明葛根素和葛根多肽均對肝臟細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，且存在一定的量效關(guān)系。

酒精性肝損傷的另一顯著特征是血脂代謝異常，表現(xiàn)為總膽固醇（CHOL）、載脂蛋白（HDL、LDL）等的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素、葛根多肽均可不同程度地降低總膽固醇CHOL水平，升高HDL水平，有一定的量效關(guān)系。但在LDL水平方面，只有葛根素能有效降低其水平。說明葛根素、葛根多肽可改善乙醇誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷造成的脂代謝異常，具體的干預(yù)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

表2 各組小鼠肝臟組織損傷評分比較（±s）

表2 各組小鼠肝臟組織損傷評分比較（±s）

注： 與 正 常 組 比 較，***P＜0.001；與 模 型 組 比 較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 劑量（mg/kg） 評分（分）正常組 10 4.36±1.02模型組 10 1.40±1.14***陽性對照組 10 0.50 3.40±0.89##葛根素組低劑量組 10 0.25 3.33±1.21##葛根素組中劑量組 10 0.50 3.42±0.78##葛根素組高劑量組 10 1.50 4.00±1.15###葛根多肽低劑量組 10 0.25 3.00±0.78#葛根多肽中劑量組 10 0.50 3.20±0.44##葛根多肽高劑量組 10 1.50 4.00±0.77###

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