范建偉， 許小凡， 辛嘉萁， 吳 楠， 段麗芳， 張 紅△

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心， 陜西 咸陽 712046)

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是臨床上常見的消化系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為胰腺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥。CP病因復(fù)雜，以胰腺漸進(jìn)性、不可逆性破壞引起胰腺內(nèi)外分泌腺功能缺陷為特征，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。L-精氨酸(L-arginine)腹腔注射是一種被普遍認(rèn)可的復(fù)制急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)動(dòng)物模型方法[2-3]，近期也有學(xué)者開始嘗試將其用以復(fù)制CP模型[4]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示L-精氨酸能夠誘發(fā)胰腺的慢性炎癥和纖維化，但是我們課題組在以往的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，此種方法復(fù)制的CP模型病變程度不夠均一，相關(guān)指標(biāo)的組內(nèi)差異較大，影響了對(duì)CP實(shí)驗(yàn)藥物療效的評(píng)判。在探尋L-精氨酸造模不均一的原因時(shí)，本課題組發(fā)現(xiàn)在慢性胰腺炎的誘發(fā)過程中雄性小鼠的胰腺病理損傷程度似乎重于雌性小鼠，然而，不同性別小鼠對(duì)L-精氨酸造模的敏感性是否存在差異目前尚不清楚。因此，本研究通過觀察L-精氨酸對(duì)CP 的誘導(dǎo)作用及性別對(duì)成模的影響，擬尋找一種穩(wěn)定、均一的CP造模方法，確保CP相關(guān)藥物療效評(píng)價(jià)的可靠性。

材 料 和 方 法

1藥品、試劑和儀器

L-精氨酸(A6969-100G)購于Sigma-Aldrich；抗F4/80(18705-1-AP)抗體購于Proteintech；抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA;bs-10196R)抗體和抗纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N;bsm-33143M)抗體購于博奧森試劑公司；抗GAPDH(BM1623)抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔(BA1054)及羊抗小鼠(BA1050)II 抗購于博士德試劑公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于碧云天；Masson染色試劑盒購于南京建成生物研究所；RNA提取試劑(9767)、反轉(zhuǎn)錄及real-time PCR試劑(RR047A、RR820A)購于TaKaRa；其它試劑為當(dāng)?shù)厣镏苿┕咎峁┑姆治黾兓瘜W(xué)試劑。Western blot電泳儀器(Bio-Rad)；7500 PCR儀(ABI)；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(ProteinSimple)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組及造模 健康昆明小鼠84只，雌雄小鼠各42只，6～8周齡，體重20～28 g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)0001249)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為4組(對(duì)照組n=18，每時(shí)點(diǎn)6只；CP組n=24，每時(shí)點(diǎn)8只)：雌性對(duì)照(female control， F-control)組、雌性CP(F-CP)組、雄性對(duì)照(male control，M-control)組和雄性CP(M-CP)組。CP組給予腹腔注射20% L-精氨酸(3 g/kg)，每周1次，每次2輪，間隔1 h。對(duì)照組給予腹腔注射與L-精氨酸等體積的生理鹽水。

2.2標(biāo)本采集與檢測 分別在造模后2、4和6周麻醉處死動(dòng)物，完整摘除胰腺，均勻分配胰腺頭、體、尾部，將部分胰腺組織置于10%中性甲醛溶液浸泡固定，另一部分胰腺組織迅速放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)提取RNA及蛋白。

2.3胰腺組織病理學(xué)觀察 經(jīng)10%中性甲醛溶液浸泡固定后的胰腺組織脫水、石蠟包埋、3 μm切片，HE及Masson染色觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)改變及纖維化程度。

2.4免疫組織化學(xué)染色觀察胰腺組織F4/80的表達(dá) 取胰腺組織3 μm切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液煮沸抗原修復(fù)后室溫冷卻，PBS洗3次，每次5 min，3% H2O2室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物；正常山羊血清封閉液室溫孵育40 min；抗F4/80的 I 抗(1∶150) 4 ℃過夜，生物素化羊抗兔IgG II 抗(1∶500)，37 ℃孵育1 h；SABC，37 ℃孵育30 min；DAB顯色、復(fù)染、鏡檢、脫水、封片。

2.5Real-time PCR檢測胰腺組織白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、α-SMA及FN的mRNA表達(dá) IL-6、α-SMA及FN引物序列見表1，按試劑盒的操作步驟提取胰腺組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件(20 μL體系)：SYBR 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ROX reference dye Ⅱ 0.08 μL，cDNA(20 mg/L) 6 μL，ddH2O 2.32 μL。擴(kuò)增條件為:50 ℃預(yù)熱 2 min；95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性 5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2.6Western blot 檢測胰腺組織α-SMA及 FN的蛋白表達(dá) 取胰腺組織50 mg，加蛋白裂解液500 μL充分勻漿，冰上孵育1 h，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，提取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量后，加入6×loading buffer將樣品稀釋至4 g/L。以相應(yīng)分子量的Marker為參照，SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液(5%脫脂奶粉)中緩慢搖蕩1 h，滴加 I 抗分別為GAPDH(1∶1 000)、α-SMA(1∶400)及FN(1∶400)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST漂洗3次(每次5 min)。HRP標(biāo)記的 II 抗(羊抗小鼠或羊抗兔IgG 1∶2 000)，室溫孵育1 h。 TBST漂洗3次(每次5 min)。滴加ECL，在Protein Simple化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，選取適當(dāng)時(shí)間曝光并拍照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1胰腺組織病理學(xué)變化及纖維化程度

如圖1、2所示，雌、雄對(duì)照組小鼠胰腺小葉及導(dǎo)管結(jié)構(gòu)正常;雌性小鼠在造模后2周僅見胰腺輕度間質(zhì)水腫、少量炎癥細(xì)胞浸潤，而雄性小鼠除大量胰腺組織萎縮、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤外，還可見少量膠原纖維的沉積；雄性小鼠在造模后4和6周時(shí)胰腺損傷進(jìn)一步加重，可見腺泡萎縮形成管狀化，胰腺組織結(jié)構(gòu)大面積消失，被膠原纖維所取代，而雌性小鼠的胰腺損傷程度明顯輕于雄性小鼠，造模后6周僅見少量胰腺腺泡細(xì)胞萎縮、纖維化沉積及炎細(xì)胞浸潤。

Figure 1. The pancreatic morphology of the mice induced by 20% L-arginine (HE staining, ×100).

圖1胰腺組織的病理學(xué)改變

2胰腺組織α-SMA的表達(dá)

如圖3所示，與造模前相比較，造模后2周雄性CP組胰腺α-SMA的mRNA表達(dá)水平明顯升高，而雌性CP組無明顯變化。造模后4和6周，雄性CP組胰腺α-SMA mRNA的表達(dá)較2周時(shí)有所下降，但仍維持較高水平；雌性CP組α-SMA的mRNA表達(dá)則較2周明顯升高，但其表達(dá)水平仍低于同時(shí)點(diǎn)的雄性CP組(P<0.05)。

Figure 2. The degree of fibrosis in pancreatic tissues (Masson staining, ×100).

圖2胰腺組織的纖維化程度改變

Figure 3. The mRNA expression of α-SMA in the pancreas of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsfemale group;#P<0.05,##P<0.01vssame-sex control group.

圖3各組胰腺組織α-SMAmRNA表達(dá)的變化

如圖4所示，在造模后2周，雌、雄CP組α-SMA的蛋白表達(dá)均未見明顯升高，但在造模后4和6周α-SMA的蛋白水平則隨著病程進(jìn)展明顯升高，雄性小鼠的α-SMA的蛋白表達(dá)水平明顯高于同時(shí)點(diǎn)的雌性小鼠(P<0.05)。

3胰腺組織FN的表達(dá)變化

如圖5所示，與造模前相比較，在造模后2周雄性CP組胰腺FN的mRNA表達(dá)水平即開始升高，至6周時(shí)急劇升高；而雌性CP組胰腺FN的mRNA表達(dá)水平雖較對(duì)照組有所升高，但與同時(shí)點(diǎn)的雄性CP組相比較仍明顯較低(P<0.01)。

Figure 4. The protein level of α-SMA in the pancreas of mice. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsfemale group;#P<0.05,##P<0.01vssame-sex control group.

圖4各組胰腺組織α-SMA蛋白表達(dá)的變化

Figure 5. The mRNA expression of FN in the pancreas of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsfemale group;#P<0.05,##P<0.01vssame-sex control group.

圖5各組胰腺組織FNmRNA表達(dá)的變化

如圖6所示，在造模后2周，雌、雄組胰腺FN的蛋白表達(dá)水平均未見明顯變化，隨著造模時(shí)間的延長，F(xiàn)N的蛋白表達(dá)水平有所升高，尤其是在造模后6周雄性組小鼠FN的蛋白表達(dá)明顯高于同時(shí)點(diǎn)的雌性組小鼠(P<0.01)。

4胰腺組織巨噬細(xì)胞浸潤

如圖7所示，空白對(duì)照組胰腺組織結(jié)構(gòu)良好，無炎癥細(xì)胞的浸潤，故未見巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物F4/80陽染表達(dá)。復(fù)制CP模型后，可見胰腺組織F4/80陽染的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，尤以雄性組小鼠明顯；雄性小鼠在造模后4和6周胰腺組織可見大量F4/80陽染的巨噬細(xì)胞，明顯高于雌性小鼠。

5胰腺組織IL-6的mRNA表達(dá)

如圖8所示，與造模前相比較，造模后2周，雌、雄小鼠胰腺IL-6的mRNA表達(dá)水平均明顯升高，但雄性小鼠的表達(dá)水平顯著高于雌性小鼠(P<0.01)。

Figure 6. The protein level of FN in the pancreas of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsfemale group;#P<0.05,##P<0.01vssame-sex control group.

圖6各組胰腺組織FN蛋白表達(dá)的變化

Figure 7. F4/80 activity in the pancreas of mice with chronic pancreatitis (IHC， ×400).

圖7各組胰腺組織F4/80表達(dá)的變化

Figure 8. The mRNA expression of IL-6 in the pancreas of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsfemale group;#P<0.05vssame-sex control group.

圖8各組胰腺組織IL-6mRNA表達(dá)的變化

在造模后4周，2組小鼠IL-6的mRNA水平均有所下降，但雄性小鼠的表達(dá)水平仍明顯高于雌性小鼠(P<0.05)。

討 論

L-精氨酸是一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成底物，可通過減少多胺合成，抑制核酸和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生[5-6]。Tani等[7]首次發(fā)現(xiàn)腹腔注射L-精氨酸可以造成胰腺腺泡細(xì)胞的損傷，后續(xù)的研究對(duì)其原因進(jìn)行分析認(rèn)為：一方面L-精氨酸可能通過抑制胰腺腺泡細(xì)胞蛋白質(zhì)合成損害細(xì)胞；另一方面L-精氨酸可能通過促進(jìn)NO合成，引起血管擴(kuò)張和胰腺低灌注，導(dǎo)致胰腺發(fā)生缺血壞死及炎癥反應(yīng)[5，8-9]。大量研究證實(shí)，L-精氨酸可誘發(fā)胰腺急性炎癥反應(yīng)，已被廣泛用于復(fù)制AP動(dòng)物模型[2-3,10]。胰腺纖維化是CP發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，有研究認(rèn)為胰腺纖維化發(fā)生的重要原因與反復(fù)發(fā)作的壞死性炎癥反應(yīng)有關(guān)[11]，而L-精氨酸所復(fù)制的AP模型可見胰腺組織的炎癥和壞死發(fā)生，學(xué)者們近年來也開始嘗試將其用于CP動(dòng)物模型的復(fù)制，經(jīng)多項(xiàng)研究證實(shí)，反復(fù)多次腹腔注射L-精氨酸能夠誘發(fā)胰腺的慢性炎癥和纖維化，是復(fù)制小鼠CP動(dòng)物模型的可靠方法[4，12]。然而我們?cè)谇捌诘难芯恐卸啻畏磸?fù)采用L-精氨酸復(fù)制小鼠CP模型，發(fā)現(xiàn)L-精氨酸腹腔注射誘發(fā)的胰腺損害程度在不同個(gè)體間存在明顯的差異，模型病變不夠均一。搜尋其原因，發(fā)現(xiàn)L-精氨酸造模后6周雄性小鼠胰腺纖維化的程度似乎明顯超過雌性小鼠。那么，L-精氨酸復(fù)制的小鼠CP胰腺損傷程度是否存在性別差異值得深入研究。

為了探明CP進(jìn)展過程中性別對(duì)其病程的影響，我們采用相同周齡健康昆明小鼠，觀察造模后2周、4和6周雌雄小鼠胰腺損傷程度及炎癥反應(yīng)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，雌雄空白對(duì)照組小鼠胰腺小葉及導(dǎo)管結(jié)構(gòu)正常，在造模后2周，雌性小鼠僅見胰腺輕度間質(zhì)水腫、少量炎細(xì)胞浸潤，而雄性小鼠除了大量胰腺組織萎縮、壞死及炎性細(xì)胞浸潤外，還可見少量膠原纖維的沉積。造模后4周、6周雄性小鼠的胰腺損傷進(jìn)一步加重，可見腺泡萎縮形成管狀化結(jié)構(gòu)，胰腺組織結(jié)構(gòu)大面積消失，被膠原纖維所取代。雌性小鼠的胰腺損傷程度明顯輕于雄性小鼠，在造模后6周僅見少量腺泡細(xì)胞萎縮、纖維化沉積，及胰腺炎細(xì)胞浸潤。近年來的研究顯示，胰腺纖維化的本質(zhì)就是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過度沉積，而ECM的生成與胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cell，PSC)活化密切相關(guān)[13-15]。PSC活化后的主要表現(xiàn)為[16-17]： 細(xì)胞體積變大，增殖活躍，細(xì)胞內(nèi)脂滴消失； 表達(dá)α-SMA；產(chǎn)生ECM，如I型、III型膠原蛋白和FN等。已有大量研究證實(shí)PSC在胰腺纖維化中的核心地位，指出胰腺纖維化程度與PSC的活化程度呈正相關(guān)[18]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠造模后胰腺組織α-SMA和FN的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯增高，與雌性小鼠相比表達(dá)時(shí)點(diǎn)更早，隨著造模時(shí)間的延長，其表達(dá)水平更高。故提示L-精氨酸誘導(dǎo)的CP模型在雄性小鼠纖維化出現(xiàn)更早，病變程度更嚴(yán)重。而流行病學(xué)研究亦顯示，CP多見于40歲以上患者，發(fā)病率在不同性別存在明顯差異，男性發(fā)病率明顯高于女性，達(dá)3.38∶1[19]。

其實(shí)性別差異在很多疾病的動(dòng)物模型均有存在，許君望等[20]采用四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)雌、雄大鼠對(duì)CCl4致肝纖維化的反應(yīng)性存在明顯差別，雌性大鼠的反應(yīng)性明顯弱于雄性大鼠。在小鼠急性肝損傷動(dòng)物模型的研究中，謝湘媚等[21]發(fā)現(xiàn)雄性小鼠對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的耐受性低于雌性小鼠。張琪娟等[22]采用蛋氨酸和膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)昆明小鼠非酒精性脂肪肝炎模型，發(fā)現(xiàn)雄性小鼠肝損傷程度更為嚴(yán)重，存在明顯性別差異，尤其體現(xiàn)在炎癥反應(yīng)上。進(jìn)一步分析雌雄小鼠CP成模程度差異的原因，我們發(fā)現(xiàn)在造模后2周、4周雄性小鼠胰腺巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物F4/80免疫組化的陽染率明顯高于雌性小鼠，而胰腺IL-6的mRNA表達(dá)水平在雄性小鼠造模后2周亦明顯升高，與同時(shí)點(diǎn)雌性小鼠比較存在非常顯著差異，提示雄性小鼠在造模后早期胰腺組織就有炎細(xì)胞大量浸潤，引發(fā)更加嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。

綜上所述，L-精氨酸腹腔注射給藥方式簡單、價(jià)格相對(duì)低廉，且可以成功誘發(fā)小鼠胰腺纖維化，是一種可靠的CP造模方式。但本研究發(fā)現(xiàn)L-精氨酸所誘發(fā)的CP在雌雄小鼠存在差異，主要表現(xiàn)為胰腺組織炎癥損傷、腺泡萎縮及胰腺間質(zhì)纖維化程度的差異，這一差異可能與促炎因子IL-6表達(dá)上調(diào)，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)的同時(shí)促進(jìn)PSC活化有關(guān)。由于L-精氨酸誘導(dǎo)的CP在昆明小鼠存在明顯的性別差異，提示我們：在進(jìn)行藥物療效評(píng)價(jià)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)選擇同種性別的小鼠，以免因性別不同造成動(dòng)物間模型程度的差異，影響藥物療效評(píng)價(jià)的客觀性。鑒于雄性小鼠可能對(duì)L-精氨酸更敏感，引發(fā)的胰腺炎癥反應(yīng)及纖維化程度出現(xiàn)更早、更明顯，認(rèn)為雄性小鼠更適用于L-精氨酸復(fù)制CP動(dòng)物模型，建議最好選擇雄性小鼠進(jìn)行治療對(duì)比實(shí)驗(yàn)，更有利于對(duì)CP治療藥物的療效評(píng)價(jià)。

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