余 璐， 林 立， 李海燕， 溫順航， 張海鄰， 李昌崇

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 育英兒童醫(yī)院， 浙江 溫州 325027)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，SP)是兒童社區(qū)獲得性肺炎的最常見病原細菌。肺炎鏈球菌肺炎的嚴重度與細菌表面毒力因子及宿主自身免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

分泌型白細胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI)存在于上皮細胞，包括氣管和支氣管上皮細胞及肺泡II型上皮細胞，是一種非糖基化單鏈多肽蛋白，具有抗菌、抗病毒和抗炎等多方面生物學(xué)活性[1]。有研究表明，姜黃素(curcumin，Cur)具有抑菌、抗炎和抗氧化等多種生物學(xué)活性，在細菌感染性疾病中有治療潛能，但Cur在溶液中穩(wěn)定性低，因而生物學(xué)活性受影響，而其衍生物Y20(C21H16BrF3O)和6B(C26H25NO7)穩(wěn)定性高，克服了姜黃素這一缺點。目前SP感染后SLPI的分泌情況及Cur及其衍生物Y20和6B對SLPI表達的影響尚無定論。本研究通過建立SP體外感染模型，以Cur、Y20和6B預(yù)處理，在感染各時點檢測SLPI、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)p65的水平，探討Cur及其衍生物對SP感染時SLPI、TNF-α和IL-1β表達的調(diào)控及可能機制，同時比較3種藥物對SP感染后SLPI、TNF-α和IL-1β表達的不同影響。

材 料 和 方 法

1實驗材料

1.1細胞與細菌 肺炎鏈球菌購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。人支氣管上皮細胞BEAS-2B 購自中科院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.2主要試劑 澳洲胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液、鏈/青霉素、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)等購自Thermo Fisher Scientific；抗NF-κB p65和TLR2抗體購自Cell Signaling Technology；人TNF-ɑ和IL-1β ELISA定量試劑盒購自上海西塘有限公司；TRIzol試劑購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；哥倫比亞血瓊脂平板購自溫州康泰生物科技有限公司；姜黃素、Y20和6B由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院梁廣教授饋贈。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。

2實驗方法

2.1體外感染模型建立 用0.25%胰蛋白酶消化貼壁培養(yǎng)的BEAS-2B細胞，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，以3×108/L密度鋪于6孔板，實驗分為空白對照(control)組、SP感染(SP)組和藥物干預(yù)組(分別為Cur、Y20和6B組)，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d(37 ℃、5% CO2)。待細胞生長匯聚至80%左右時，換無雙抗的完全培養(yǎng)基，空白對照組和SP感染組加入1‰ DMSO，藥物干預(yù)組分別加入濃度為10 μmol/L的Cur、Y20和6B預(yù)處理6 h。3種藥物皆使用DMSO溶解，分別配置濃度為10 μmol/L，最終使各處理組培養(yǎng)液中DMSO濃度固定為1‰。根據(jù)感染復(fù)數(shù)(multiple of infection，MOI)=20在每組中加入吸光度(A)為0.5的SP菌懸液(1.5×108CFU)，置于細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、6和9 h。

2.2qPCR檢測BEAS-2B細胞SLPI、TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達 取體外感染模型，棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL TRIzol提取RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)成cDNA，進行qPCR檢測。配制成10 μL的體系，包括cDNA 1 μL、SYBR 5 μL、上下游引物各1 μL及DEPC水2 μL。反應(yīng)體系為95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，進行45個循環(huán)。每組設(shè)置3個復(fù)孔，各時點實驗獨立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法分析。引物序列見表1。

表1 qPCR的引物序列

2.3ELISA法檢測BEAS-2B細胞TNF-α和IL-1β的蛋白含量 收集不同感染時間的細胞培養(yǎng)液，離心取上清后按說明書測定TNF-α和IL-1β蛋白表達量，采用多功能酶標儀于450 nm處測A值，繪制標準曲線，根據(jù)吸光度值換算TNF-α和IL-1β含量。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗獨立重復(fù)3次。

2.4Western blot檢測細胞BEAS-2B TLR2和NF-κB p65蛋白的水平 收取不同感染時間的細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3遍后，每孔加入70 μL裂解液于冰上裂解20 min。超聲，離心，配制20 μL體系，100 ℃變性10 min，8% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入1∶500稀釋的抗TLR2抗體和1∶1 000稀釋的抗NF-κB p65抗體4 ℃孵育16～18 h，次日取出，TBST洗膜，加入1∶5 000稀釋的II抗，室溫搖床孵育2 h，再次洗膜后，進行曝光、顯色。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6進行數(shù)據(jù)處理和作圖，實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，進行方差齊性檢驗，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1SP誘導(dǎo)BEAS-2B細胞表達SLPI及Cur、Y20和6B對SLPI表達的影響

SP感染組SLPI的mRNA表達隨感染時間增加有所不同，感染時間為1 h和3 h時，SLPI的mRNA表達較對照組增加(P<0.05)，6 h表達量反而降低，而后隨著感染時間的增加而增加(P<0.05)；Cur、Y20和6B干預(yù)組SLPI的mRNA表達也隨著感染時間的變化發(fā)生類似變化，但其SLPI的mRNA表達水平較SP感染組均有上升，其中感染3 h時Cur干預(yù)組SLPI表達量增加最為明顯(P<0.05)， 6B干預(yù)6 h組增加明顯(P<0.05)， Y20干預(yù)9 h組增加明顯(P<0.05)，見表2。

表2肺炎鏈球菌感染BEAS-2B細胞不同時間及不同藥物處理后SLPI的mRNA表達變化

Table 2. The mRNA expression of SLPI in BEAS-2B cells incubated with SP for different time and with different treatments (Mean±SD.n=4)

Group1h3h6h9hControl1111SP1．845±0．179?1．465±0．065?1．145±0．0792．241±0．210?Cur1．466±0．0382．050±0．122#1．569±0．136△2．302±0．226Y201．881±0．1451．697±0．1801．254±0．066△3．036±0．438#6B1．395±0．1581．015±0．0541．908±0．392#2．388±0．199

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSP group;△P<0.05vs6B group.

2SP誘導(dǎo)BEAS-2B細胞TNF-α和IL-1β的表達及Cur、Y20和6B的作用

檢測BEAS-2B細胞在SP感染3、6和9 h 后TNF-α和IL-1β的mRNA和蛋白表達，其中 SP感染組的TNF-α在感染不同時點較對照組相比均有所增加，且在感染6 h時表達水平最高(P<0.05)；Cur、Y20和6B處理組的TNF-α表達較感染組相比明顯下降(P<0.05)。SP感染組的IL-1β表達較對照組上調(diào)，藥物處理后表達有較明顯的下降，且以6B預(yù)處理組的TNF-α和IL-1β下降最為明顯(P<0.05)，見表3、4。

表3肺炎鏈球菌感染BEAS-2B細胞不同時間及不同藥物處理后TNF-α的mRNA和蛋白表達變化

Table 3. The expression of TNF-α at mRNA and protein levels in the BEAS-2B cells incubated with SP for different time and with different treatments (Mean±SD.n=4)

GroupTNF?αmRNATNF?αprotein3h6h9h3h6h9hControl11112．93±0．599．81±0．8510．06±0．87SP1．341±0．1124．556±0．219?2．647±0．082?33．63±1．02?91．75±1．16?43．57±0．89?Cur0．678±0．253#2．764±0．211#2．017±0．213#14．88±0．78#10．93±0．66#31．09±1．15#Y200．648±0．144#4．288±0．1572．648±0．20718．89±4．19#12．68±0．54#34．29±1．84#6B0．308±0．061#2．865±0．178#1．852±0．315#12．76±0．86#14．80±0．90#15．92±0．78#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSP group.

表4肺炎鏈球菌感染BEAS-2B細胞不同時間及不同藥物處理后IL-1β的mRNA及蛋白表達變化

Table 4. The expression of IL-1β at mRNA and protein levels in the BEAS-2B cells incubated with SP for different time and with different treatments (Mean±SD.n=4)

GroupIL?βmRNAIL?βprotein3h6h9h3h6h9hControl1111．198±0．0471．399±0．1671．493±0．138SP1．319±0．107?4．805±0．217?4．722±0．261?2．595±0．049?7．279±0．198?2．809±0．149?Cur0．669±0．114#△3．608±0．312#△3．284±0．203#△1．608±0．095#△1．869±0．138#2．294±0．159#Y200．538±0．023#△1．725±0．095#△4．462±0．258△1．514±0．071#△1．705±0．155#2．355±0．2706B0．041±0．004#0．931±0．071#0．835±0．051#1．078±0．125#2．504±1．455#2．057±0．086#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSP group;△P<0.05vs6B group.

3SP誘導(dǎo)BEAS-2B細胞TLR2和p-NF-κBp65表達及Cur、Y20和6B的作用

檢測BEAS-2B細胞在不同感染時段TLR2和p-NF-κB p65蛋白水平的變化，結(jié)果顯示，感染3、6和9 h時，SP感染組TLR2和p-NF-κB p65的蛋白水平高于正常對照組(P<0.05)；Cur組、Y20組和6B組TLR2和p-NF-κB p65的蛋白水平較 SP感染組有所下降(P<0.05)，且在同一感染時點，6B組TLR2的蛋白水平下降程度較Cur組和Y20組更明顯，在感染9 h，6B組p-NF-κB p65的蛋白水平下降較Cur組和Y20組尤為顯著(P<0.05)，見圖1～3。

Figure 1. The protein levels of TLR2 and p-NF-κB p65 in the BEAS-2B cells infected with SP for 3 h. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSP group;△P<0.05vs6B group.

圖1肺炎鏈球菌感染BEAS-2B細胞3hTLR2和p-NF-κBp65的蛋白水平變化

討 論

SP長期定植于人體鼻咽部，是5歲以下兒童社區(qū)獲得性肺炎的首要細菌病原。有報道，發(fā)展中國家平均每年有近10萬小于5歲的兒童死于肺炎鏈球菌引起的肺炎、腦膜炎和膿毒血癥等疾病[2-3]。近年來多重耐藥菌的出現(xiàn)及兒童用藥的特殊性，使得抗生素的選擇越來越局限，新型抗菌藥物或增強抗菌肽抗菌能力的制劑已引起越來越多的關(guān)注。SLPI是人體固有抗菌肽，在抵御病原菌入侵具有重要作用。姜黃素經(jīng)常被用于細菌性疾病的治療，而眾多研究證實，姜黃素及其衍生物在抑制細菌生長及治療細菌性疾病中是有潛力的。但姜黃素水溶性差，在溶液中的穩(wěn)定性低，其衍生物Y20(C21H16BrF3O)是在姜黃素結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上去除β-二酮結(jié)構(gòu)的衍生物，6B(C26H25NO7)則是在其基礎(chǔ)上加入氮雜白藜蘆醇，穩(wěn)定性相對較高，生物學(xué)活性較好。本研究選擇Cur及其衍生物Y20和6B作為干預(yù)藥物，觀察3種藥物對SP感染BEAS-2B細胞SLPI、TNF-α和IL-1β的影響，以期篩選出抗SP感染效應(yīng)較優(yōu)的藥物。本實驗通過建立SP體外感染模型，以Cur、Y20和6B預(yù)處理，探討SP感染時SLPI、TNF-α和IL-1β表達水平及Cur、Y20和6B對SLPI、TNF-α和IL-1β等表達調(diào)控及可能機制。

Figure 2. The protein levels of TLR2 and p-NF-κB p65 in the BEAS-2B cells infected with SP for 6 h. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSP infection group.

圖2肺炎鏈球菌感染BEAS-2B細胞6hTLR2和p-NF-κBp65的蛋白水平變化

Figure 3. The protein levels of TLR2 and p-NF-κB p65 in the BEAS-2B cells infected with SP at 9 h. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSP group;△P<0.05vs6B group.

圖3肺炎鏈球菌感染BEAS-2B細胞9hTLR2和p-NF-κBp65的蛋白水平

1SP誘導(dǎo)BEAS-2B細胞表達SLPI

SLPI作為上呼吸道固有的抗菌肽之一，在宿主抗感染的固有免疫反應(yīng)中起重要作用[4]。有研究指出SLPI能減少大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核桿菌以及淋病奈瑟菌的生長繁殖，起抵御病原菌入侵作用，而且SLPI還可減輕病原菌引起的炎癥及組織損傷[5]。

本研究以SP感染BEAS-2B細胞，qPCR結(jié)果顯示，BEAS-2B細胞的SLPI表達均有所升高，表明SP能誘導(dǎo)BEAS-2B細胞表達SLPI，在感染1 h時SLPI的表達呈上升趨勢，但隨著感染時間增加，SLPI的表達呈下降趨勢，稍高于對照組，在早期對細胞起一定的保護作用。相關(guān)研究指出，LPS、TNF-α和IL-1β等可以促進SLPI的表達[6]，另有研究表明，SLPI也可以通過減少細胞炎癥因子如TNF-α和IL-1β等的分泌，減輕炎癥反應(yīng)[7]，而感染至9 h時SLPI表達顯著增加，這可能與隨著感染時間的增加，SP感染所致的炎癥反應(yīng)顯著加強，炎癥介質(zhì)釋放增加有關(guān)。

2Cur、Y20和6B促進BEAS-2B細胞表達SLPI，減輕炎癥反應(yīng)

姜黃素自1910年從姜科植物根莖中分離提純出后被證實具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗病毒等多種生物學(xué)活性[8]。研究表明姜黃素及其衍生物能抑制眾多由感染及非感染性疾病引起的炎癥因子、趨化因子和炎癥蛋白酶等的表達。Peter等[9]指出姜黃素及其衍生物能夠抑制埃博拉及其它病毒感染情況下單核細胞、巨噬細胞、人食管上皮細胞和肺泡上皮細胞等炎癥因子如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、單核細胞趨化因子1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和巨噬細胞炎癥蛋白1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)的分泌。Xu等[10]利用姜黃素治療金黃色葡萄球菌感染所致小鼠急性肺損傷實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素能減少中性粒細胞的滲透及I型纖溶酶原激活物抑制因子的活性，降低炎癥因子和趨化因子的分泌水平及肺組織損傷。劉緒華等[11]研究指出，姜黃素能減少β淀粉樣蛋白25-35(amyloid β-protein，Aβ25-35)所致大鼠神經(jīng)細胞中IL-1β和TNF-α的表達，顯著抑制神經(jīng)細胞的炎癥反應(yīng)。

本實驗研究結(jié)果顯示，感染3、6和9 h時Cur、Y20和6B干預(yù)組中IL-1β和TNF-α的表達較感染組相比有顯著下降，提示Cur、Y20和6B能減少SP感染引起的炎癥反應(yīng)，尤以6B作用更為顯著，感染1 h時IL-1β、TNF-α基本無變化，故未進行后續(xù)實驗觀察。與此同時，Cur、Y20和6B干預(yù)組在不同感染時間能不同程度地增加SLPI的表達，提示Cur、Y20和6B可能通過增加SLPI的表達抑制IL-1β和TNF-α分泌，減輕SP感染所致的炎癥反應(yīng)。

3TLR2表達的抑制可能增加SLPI的表達

TLR2在宿主對抗革蘭陽性菌的固有免疫應(yīng)答機制中具有重要作用，有研究指出，TLR2在清除和減少肺炎鏈球菌黏附及宿主防御免疫應(yīng)答中至關(guān)重要[12]。姜黃素能抑制TLR2的表達并減輕后續(xù)炎癥反應(yīng)。Tu等[13]利用姜黃素治療鼠腦缺血模型發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制TLR2的表達，減少NF-κB的表達與活化，下調(diào)下游炎癥因子如IL-1β和TNF-α的分泌。另有研究指出，姜黃素衍生物CMC2.24可作用于表面活性蛋白B(surfactant protein B，SP-B)，減少炎癥細胞的聚集，下調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性及基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，減輕金黃色葡萄球菌引起的肺損傷，改善生存率[14]。

本研究結(jié)果顯示，SP感染后BEAS-2B細胞的TLR2和pNF-κB p65蛋白水平較對照組增高，而Cur、Y20和6B干預(yù)后BEAS-2B細胞在感染3、6和9 h后 pNF-κB和TLR2的蛋白水平較感染組有不同程度的下降，以6B處理組下降明顯，提示SP可激活TLR2信號通路，上調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，Cur、Y20和6B能抑制TLR2的表達而下調(diào)NF-κB的活性，支持Tu等[13]的結(jié)論。

SLPI的表達受TLR2信號通路的調(diào)節(jié)[15]。有研究表明，SLPI能夠抑制白細胞介素1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK)、IκB(inhibitor of NF-κB)α 以及 IκBβ的激活而抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)LPS誘導(dǎo)TNF-α及TLR誘導(dǎo)的細胞因子的表達[16]。Palm等[17]通過牙齦卟啉單胞菌體外感染實驗指出TLR2基因沉默后SLPI的表達下降，表明SLPI的表達與TLR2息息相關(guān)。

本研究結(jié)果提示，SP誘導(dǎo)BEAS-2B細胞SLPI的表達隨著感染時間的變化而變化，且Cur、Y20和6B預(yù)處理后SLPI的表達較SP感染組有不同程度的增加，而TLR2表達卻有所減少，這與Palm等[17]的研究結(jié)果有所不同，可能與感染時間短，感染細菌類型不同有關(guān)。結(jié)合TLR2和p-NF-κB p65及炎癥因子在不同感染時段及藥物處理后的變化，提示SLPI可能通過對TLR2信號通路的調(diào)節(jié)，影響p-NF-κB p65及炎癥因子的水平，表明SLPI可能通過與TLR2-NF-κB的相互作用參與SP感染引起的炎癥反應(yīng)的調(diào)控。

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