竇旖君,薛永常

(大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034)

黑色素是一種廣泛存在于動植物及微生物中由酚類化合物聚合而成的多功能復雜多聚體，有真黑素、棕黑素、異黑素和類黑素4種不同類型[1],可作為生化反應的介質(zhì)[2]、溫度調(diào)節(jié)以及金屬螯合[3-4],還可作為生物反應無定形的半導體以及農(nóng)業(yè)生物殺蟲劑的光保護劑，具有抗紫外輻射、清除自由基、阻止心磷脂脂質(zhì)體氧化等功能，從而提高生物體的生存與競爭能力。同時還被作為新型天然藥物等進行研究和利用[5-7]。微生物產(chǎn)天然色素大多無毒無害，除了保留許多對人體有益的保健成分，還可以作為新的保健品[8]，很早就有微生物產(chǎn)黑色素菌株及關鍵酶等方面的研究[9-12]，黑色素在生物防御方面也有一定的作用[13]，F(xiàn)ana等[14]在傳統(tǒng)苯丙氨酸途徑基礎上發(fā)現(xiàn)了一個新的黑色素合成途徑，為探討黑色素生物合成提供一條新思路。在黑色素合成的關鍵酶中，酪氨酸酶起到了關鍵作用，可催化酪氨酸形成L-多巴，進而由異聚體復合生成多種黑色素[15]，對黑色素高產(chǎn)菌株SC-1酪氨酸酶基因的分子改造可大幅提高黑色素產(chǎn)量[16]，因此，酪氨酸酶基因表達的研究對于研究黑色素的生物合成具有廣闊的前景[17]。本研究從大連星海灣海域的海泥和海水分離出1株黑色素產(chǎn)量較高的XH2，對其生理生化特性及16S rDNA進行了鑒定，并優(yōu)化其生長條件，為后續(xù)該菌株相關黑色素合成關鍵酶基因的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 采集大連市星海灣海域退潮后的海灘或潮間帶深處的海泥、海水。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①篩選培養(yǎng)基[5]：海水2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，F(xiàn)ePO40.1 g，瓊脂 20 g，陳海水1 L，pH 7.2～7.6；②L-Tyr發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：葡萄糖1 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，CaCl20.1 g，L-酪氨酸1 g，用海水定容至1 L，pH 7.2。固體培養(yǎng)基加瓊脂粉20 g，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器和試劑Dzup基因組抽提試劑盒(生工公司)，16S rDNA引物(華大基因)，TaqDNA polymerase、dNTPs Mix、10×buffer(寶生物公司(大連))，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。Chemi System UVP Bio-imaging System凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)，TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(日本TaKaRa公司)，DYY-2C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，V-1100D分光光度計(上海美譜達)。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選與分離 采集的海泥、海水經(jīng)梯度稀釋，均勻涂布于2216E固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，選取黑色菌落并多次分離純化獲得單菌落。將得到的單菌落接在L-Tyr固體培養(yǎng)基中，比較產(chǎn)黑色素生長情況。

1.2.2 菌株形態(tài)及生理生化鑒定 將菌株在2216E培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，取單菌落，在顯微鏡下觀察菌落大小、形態(tài)、顏色等特征，采用革蘭染色法在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18-19]對該菌種進行糖發(fā)酵試驗、氧化發(fā)酵試驗，過氧化氫酶、明膠酶、淀粉酶、檸檬酸鹽利用等實驗。

1.2.3 不同生長條件對菌株生長及產(chǎn)黑色素的影響 將活化后的菌液以1%(體積分數(shù))接種于L-Tyr發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min振蕩48 h，測菌液OD600值。取上清液測OD400[6，20]值考察不同溫度、NaCl濃度、酪氨酸含量、CaCl2含量對菌株生長和產(chǎn)黑色素的影響，并確定最佳生長條件。然后將活化后的菌液以1%的接種量接種于調(diào)整后的L-Tyr發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min振蕩48 h，測定菌液OD600值，每隔3 h取1次樣，記錄數(shù)據(jù)并繪制菌株生長曲線，分析菌株生長特性。

1.2.4 黑色素的制備及溶解性質(zhì)研究 黑色素的提取[21-22]：發(fā)酵液過濾除去菌體，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至12，121 ℃高壓處理20 min，5 000 g離心5 min，上清液用1 mol/L HCl調(diào)pH至2，沉淀過夜；12 000 g離心20 min，沉淀用pH為12的去離子水重懸，離心后烘干稱重[5]。然后取相同質(zhì)量已烘干的黑色素樣品置于盛有等量去離子水、NaOH、HCl、有機溶劑(分別裝有乙醇、苯酚、二甲苯、氯仿)的試管中，充分混勻，觀察其溶解性。

1.2.5 酪氨酸酶測定 酪氨酸酶提取及測定參考文獻[23-24]。①XH2粗酶液的制備：發(fā)酵菌液在4 ℃、10 000 g離心，菌體用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗滌2次。將菌懸液的離心管置于冰浴中，超聲波破碎。離心收集上清液，用于測定酶活和蛋白濃度。②酶活測定：取一定量粗酶液用0.10 mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.2)稀釋，取0.1 mL稀釋液于10 mL比色管中，加入2.5 mL 0.10 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH=6.0)，再加入2 mL濃度為0.10 mol/L多巴溶液，開始計時，測定OD480值。前6 min內(nèi)每分鐘測1次OD值，以后隔2 min測1次，直至OD值不變?yōu)橹?。分別取0.2、0.3、0.4 mL已稀釋提取液重復上述實驗(總體積為5 mL)。 以OD值對時間作圖得出酶活與時間的線性回歸方程，由公式a=ΔA/(ktV)×10-6(a為所用溶液的酶的活性，ΔA為最大吸收波長吸光度的變化，t為時間(min)，k為多巴紅的摩爾吸收系數(shù)，V為加入酶的體積(mL))，A=aV/V0(A為原料總酶活,V0為粗酶液總質(zhì)量(g))，計算酶活性。

1.2.6 產(chǎn)黑色素菌株的16S rDNA分子生物學鑒定 利用試劑盒提取XH2基因組DNA，利用細菌16S rDNA基因序列的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增基因組的16S rDNA序列。擴增產(chǎn)物由北京華大基因技術公司進行序列測定。將獲得的測序結(jié)果進行拼接，NCBI在線Blast，進行序列比對和相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)鑒定

利用2216E培養(yǎng)基分離出多株產(chǎn)黑色素菌株。其中菌株XH2分泌黑色素較快，在培養(yǎng)初期為透明或淡黑褐色，菌落表面平滑，單菌落較小，培養(yǎng)36 h后，可觀察到明顯黑色素產(chǎn)生，且所產(chǎn)出的黑色素可分泌到培養(yǎng)基中呈黑褐色；該菌在2216E培養(yǎng)基中即可合成黑色素，而在含有L-Tyr的發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)黑色素狀態(tài)明顯好于2216E培養(yǎng)基(圖1)，說明L-Tyr對XH2產(chǎn)黑色素有促進作用。

圖1 XH2在2216E(A)和L-Tyr發(fā)酵培養(yǎng)基(B)中的生長和產(chǎn)黑色素情況Fig.1 Strain XH2 growth and production of melanin in 2216E(A) and L-Tyr fermentation media(B)

2.2 菌株生理生化鑒定

XH2的糖酵解等生理生化鑒定及顯微鏡觀察的具體結(jié)果見表1。生理生化結(jié)果表明XH2為桿狀革蘭陰性菌，無芽胞和鞭毛，糖類轉(zhuǎn)化能力較弱，主要碳源為葡萄糖，且在L-酪氨酸為底物的培養(yǎng)基中有產(chǎn)黑色素的能力，說明有酪氨酸酶參與黑色素的代謝[23]，XH2基本生理生化實驗結(jié)果與陳靜等[25]篩選的假交替單胞菌CHS相似。

表1 XH2生理生化及形態(tài)觀察結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of XH2

注：“+”為陽性反應(有現(xiàn)象)；“-”為陰性反應(無現(xiàn)象)

2.3 培養(yǎng)條件對XH2生長及產(chǎn)黑色素的影響

2.3.1 溫度 以1%的接種量將XH2菌液接入250 mL三角瓶中，180 r/min連續(xù)培養(yǎng)72 h，分別于15、20、25、28、37 ℃進行觀察，OD600值反映菌株生長情況，OD400值可以反映菌株黑色素合成情況，結(jié)果見圖2。綜合OD600和產(chǎn)黑色素的情況，XH2在20 ℃時產(chǎn)黑色素情況最佳，37 ℃基本死亡，相較于朱琳等[26]篩選出的最適生長溫度為37 ℃的菌株，XH2培養(yǎng)溫度范圍更適宜實際操作。

圖2 溫度對XH2生長及產(chǎn)黑色素情況的影響

2.3.2 pH值 在相同條件下，分別調(diào)整培養(yǎng)基的pH為4、5、6、7、8、9、10，180 r/min連續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察其產(chǎn)黑色素情況，結(jié)果見圖3。由圖3可見，XH2在pH值為7時生長狀況和產(chǎn)黑色素情況最好，酸性條件抑制菌株生長，菌株更適宜在弱堿性環(huán)境中生長，適宜后期處理工作。

圖3 不同pH對XH2的生長及產(chǎn)黑色素情況影響Fig.3 Effect of different pH on the growth and the production of Melanin of XH2

2.3.3 NaCl含量 相同條件下，在L-酪氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量分數(shù)為0、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、6%的NaCl，180 r/min連續(xù)培養(yǎng)72 h，產(chǎn)黑色素結(jié)果見圖4。由圖4可見，XH2在NaCl含量為0.5%～3%的海水培養(yǎng)基中生長狀況良好，由于海洋菌特性，在不含海水及NaCl的培養(yǎng)基中，XH2無法生長。XH2生長最適NaCl濃度為0.5%，最適產(chǎn)黑色素濃度為1%。濃度過高，細胞形態(tài)受到破壞，生長和產(chǎn)黑色素情況受到抑制，XH2生長無需過高濃度，不同于已篩選的海洋菌株QJNY82[6]需要增加大量鹽分。

圖4 不同NaCl含量對XH2生長及產(chǎn)黑色素情況的影響Fig.4 Effect of different NaCl concentration on the growth and the production of Melanin of XH2

2.3.4 L-Tyr含量 相同條件下，在L-酪氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的L-Tyr，180 r/min連續(xù)培養(yǎng)72 h，結(jié)果見圖5。

XH2在L-酪氨酸質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，產(chǎn)黑色素能力最佳，在1 g/L時菌株生長狀態(tài)最佳，當培養(yǎng)基中L-酪氨酸質(zhì)量濃度大于1 g/L時，出現(xiàn)不溶現(xiàn)象，給菌株生長造成一定影響。L-酪氨酸的適當添加可明顯提高菌株黑色素的產(chǎn)量[6]，由于蛋白胨也含有少量游離的酪氨酸[5]，菌株在培養(yǎng)基不添加酪氨酸的條件下也可產(chǎn)黑色素。但在不含蛋白胨的培養(yǎng)基中，菌株生長狀態(tài)不佳，而且沒有黑色素產(chǎn)生。因此可以證明，XH2黑色素的產(chǎn)生需要L-酪氨酸作為底物誘導。證明了XH2黑色素合成過程中有酪氨酸酶的參與[26]。

圖5 L-Tyr含量對XH2生長及產(chǎn)黑色素情況的影響Fig.5 Effect of L-Tyr on the Growth and the Production of Melanin of XH2

2.3.5 CaCl2含量 相同條件下，在L-酪氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 g/L的CaCl2，180 r/min連續(xù)培養(yǎng)72 h，結(jié)果見圖6。圖6表明，CaCl2質(zhì)量濃度在0.1 g/L時，XH2生長狀態(tài)最佳，當質(zhì)量濃度過高時，會改變細胞膜通透性，菌株生長狀態(tài)不佳。

圖6 CaCl2含量對XH2生長及產(chǎn)黑色素情況的影響Fig.6 Effect of CaCl2 content on the growth and the production of melanin of XH2

2.4 菌株生長曲線及產(chǎn)黑色素情況的測定

采用產(chǎn)黑色素最佳條件培養(yǎng)XH2，20 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，測OD600值。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖1 g、蛋白胨5 g、NaCl 10 g、CaCl20.1 g、L-Tyr 0.5 g、陳海水1 L，pH 7.0。時間對其生長及產(chǎn)黑色素影響見圖7、8。

圖7 XH2生長曲線Fig.7 Growth curve of XH2

圖8 培養(yǎng)時間對XH2黑色素產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of culture time on the yield of XH2 melanin

從圖7可以看出，XH2是1株生長周期較長的菌株。0～3 h處于延遲期，菌株生長緩慢；3～24 h處于對數(shù)期，菌株數(shù)量呈對數(shù)增加，菌株繁殖迅速；從27 h開始，菌株增長速度減慢，處于恒定期，這一階段一直延續(xù)到72 h，菌株繁殖速度穩(wěn)定，增長遲緩，無明顯下降趨勢。從圖8可以看出，黑色素從菌株生長的6～8 h開始生成，并隨菌株生長狀態(tài)逐漸累積，有兩個大量增長的階段，分別是菌株對數(shù)生長期及后期菌株生長穩(wěn)定期的積累，且與OD400值呈一定的正相關關系。優(yōu)化后的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)72 h，產(chǎn)黑色素量為1.164 g/L，相較于優(yōu)化前不添加酪氨酸時的0.441 g/L，產(chǎn)量大約提高了2.6倍，說明添加適量L-酪氨酸可以大大提高黑色素的產(chǎn)量。對XH2產(chǎn)黑色素發(fā)酵條件的優(yōu)化可以提高XH2黑色素的產(chǎn)量，說明XH2是1株性狀優(yōu)良且適宜在工業(yè)生產(chǎn)中應用的菌株。

2.5 XH2所產(chǎn)黑色素的溶解性測定

取1 g烘干的黑色素樣品，分別置于各盛有1 mL去離子水、NaOH、HCl及有機溶劑(分別為乙醇、苯酚、二甲苯、氯仿)的試管中，充分混勻，結(jié)果見表2。

表2 XH2產(chǎn)黑色素溶解性結(jié)果Table 2 Solubility of XH2 produced melanin

注：“+”為溶解；“-”為不溶解

從表2可以看出，XH2所產(chǎn)黑色素不溶于酸性環(huán)境和有機溶劑，在堿性環(huán)境下可以溶解。

2.6 酪氨酸酶活性測定

由培養(yǎng)基中酪氨酸含量優(yōu)化結(jié)果可以驗證XH2代謝過程中有酪氨酸酶的參與，測得的不同酶液加入量和不同反應時間的關系見圖9、10。

圖9 前六分鐘吸光度隨時間變化情況Fig.9 The change situation of absorbancy with time for first six minutes

圖10 吸光度隨時間變化情況Fig.10 The change situation of absorbancy with time

可見前6 min的變化基本趨于直線，所得酶的動力學方程如下：y1=0.019k1+0.084 3,y2=0.030 1k2+0.145 9,y3=0.436k3+0.252,y4=0.397k4+0.285 6。計算出的酶活結(jié)果見表3。

表3 提取液和原料中酶的活性Table 3 The data of enzyme activity in the extract and materials

2.7 XH2菌株的16S rDNA擴增及測序結(jié)果分析

以XH2的基因組DNA為模板，利用16S rDNA通用引物進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，能夠清晰觀察到1條1 500 bp左右的條帶，與預期大小基本一致(圖11)。

擴增產(chǎn)物經(jīng)雙向測序后經(jīng)拼接得知擴增的序列長度為1 400 bp。將該序列在NCBI上進行Blast比對，結(jié)果顯示XH2與假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)親緣關系比較接近。

選取幾個相似序列構建進化樹，結(jié)果表明XH2的16S rDNA與Pseudoalteromonassp.S-2 rRNA基因序列相似度達99%，綜合2.2的生理生化鑒定，參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]，確定XH2屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)(圖12)。

圖11 產(chǎn)黑色素菌株XH2的16S rDNA擴增圖Fig.11 Agrose gel electrophoresis analysis of strain XH2 16S rDNA AmplifyM:DNAmarker D2000

圖12 基于XH2 16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.12 Phylogenetic tree based on XH2 16S rDNA sequence

3 討 論

本研究從大連星海海域篩選出1株產(chǎn)黑色素菌株XH2，通過單因素實驗，測定了XH2的生長曲線及黑色素隨時間的增長量。證明L-酪氨酸對于細菌產(chǎn)黑色素影響十分關鍵，L-酪氨酸的添加能夠明顯提高菌株黑色素產(chǎn)量，其主要原因是酪氨酸酶可以催化L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為L-多巴并生成黑色素。測定了XH2菌株發(fā)酵液中的酪氨酸酶活性,驗證了酪氨酸酶參與細胞產(chǎn)黑色素,根據(jù)生理生化鑒定結(jié)果和16S rDNA序列比對結(jié)果，確定XH2屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)。

目前，對于天然產(chǎn)黑色素菌株的研究日益增多，但對于產(chǎn)黑色素海洋假交替單胞菌產(chǎn)黑色素菌株的研究還比較少，XH2的發(fā)現(xiàn)為這一研究提供了新的研究對象。如果針對XH2產(chǎn)黑色素的酪氨酸酶基因進行操作，從分子水平上發(fā)掘出新的提高黑色素合成的方法，應用到食品及化工產(chǎn)品加工行業(yè)，將有積極作用。