劉煥燕，楊 波，李 琴，楊 光

（1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 竹類研究所，杭州 310023）

竹筍屬于禾本科竹亞科，是一種快速增長(zhǎng)的多功能林業(yè)植物。在中國(guó)、日本和其他亞洲國(guó)家，竹筍栽培及食用的歷史悠久，被廣泛應(yīng)用于建材、家具、紙張、筷子和食物來(lái)源等方面[1-3]。浙江是竹子大省，盛產(chǎn)毛竹筍、雷竹。近年來(lái)，竹筍的加工模式主要集中在傳統(tǒng)筍保鮮食品和風(fēng)味筍加工等方面，其利用率僅在30%左右，剩余部分大多被作為廢棄物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，筍殼中含有豐富的活性成分，包括多糖、黃酮、色素、甾醇和過(guò)氧化物酶等天然產(chǎn)物，筍殼作為竹筍加工剩余物，大量被廢棄，造成了資源的極大浪費(fèi)，同時(shí)帶來(lái)了環(huán)境壓力。開發(fā)再利用筍殼資源，提取其有效活性多糖物質(zhì)，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)筍殼資源的高值化利用，同時(shí)在保健食品和醫(yī)藥研究等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景[5-8]。目前，關(guān)于植物多糖的提取工藝已有較多研究，其中，熱水浸提法、酸提法、堿提法、酶解法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等是常用的方法[9]。傳統(tǒng)的熱水浸提法多糖得率較低，一定程度上制約了其開發(fā)利用；酸、堿提取法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高，易引起多糖結(jié)構(gòu)的改變；物理儀器輔助法操作復(fù)雜；酶解法具有專一性強(qiáng)、條件溫和的特點(diǎn)，采用復(fù)合酶協(xié)同作用于植物多糖的提取過(guò)程，能夠較好地促進(jìn)多糖的溶出，可極大地提高多糖得率[10-11]。

目前，尚未有關(guān)于復(fù)合酶法提取毛竹筍殼多糖的相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)復(fù)合酶法提取毛竹筍殼多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝，并對(duì)其單糖組成、體外抗氧化活性進(jìn)行探究，以期能夠最大限度地開發(fā)利用筍殼資源，提高產(chǎn)品的附加值，實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)資源的高值化，為毛竹筍殼多糖的工業(yè)提取及功能活性的深入研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

毛竹筍殼（P. heterocycla）：源自浙江省杭州市徑山鎮(zhèn)。

1.2 儀器與設(shè)備

試劑及藥品：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、三氟乙酸、單糖標(biāo)品、濃硫酸、95%的乙醇等試劑，均為分析純，購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠；2,2–聯(lián)苯基–1–苦基肼基（DPPH）、1–苯基–甲基–5–吡唑啉酮（PMP）、維生素C（Vc）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白質(zhì)酶（104U/g）、纖維素酶（3 000 U/g）、果膠酶（2 000 U/g）購(gòu)于憶諾聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司。

儀器及設(shè)備：FW 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、HH–ZK6 型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限公司）、KQ–300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、R–501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海一科儀器有限公司）、U–1900 型可見分光光度計(jì)（日本Hitachi 公司）、DZF–6020 型真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、DGX–9140 型烘箱（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco 公司）、CL31R 型多功能高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）、Sartoriμs BSA224S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 毛竹筍殼的預(yù)處理

用自來(lái)水將新鮮的毛竹筍殼清洗干凈，將其置于55 ℃的烘箱中干燥，之后粉碎，過(guò)80 目篩，備用。

1.3.2 毛竹筍殼多糖的復(fù)合酶法提取工藝

準(zhǔn)確稱取5.0 g 筍殼粉末，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照料液比1 ∶ 30（m/V），在設(shè)定的不同復(fù)合酶添加量（蛋白質(zhì)酶 ∶ 纖維素酶 ∶ 果膠酶=1 ∶ 1 ∶1）、酶解時(shí)間和酶解溫度下進(jìn)行酶解提取試驗(yàn)。酶解后得到的多糖浸提液，沸水浴10 min 滅酶，抽濾，混合全部濾液，60 ℃減壓濃縮，濃縮液加入4 倍體積的95%乙醇于4 ℃靜置過(guò)夜，5 000 r/min離心10 min，收集沉淀并經(jīng)凍干得筍殼粗多糖。

1.3.3 多糖得率的測(cè)定

采用苯酚硫酸[12]比色法，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 19.59x ? 0.021 6，調(diào)節(jié)系數(shù)R2= 0.997 3。式中：y 為吸光度；x 為葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）。準(zhǔn)確稱取2.0 g 粗多糖蒸餾水定容至100 mL，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，多糖得率計(jì)算公式為

式中：m1為凍干樣品的質(zhì)量；m0為毛竹筍殼質(zhì)量；w 為多糖含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在自然pH 條件下，按照1 ∶ 30（m/V）料液比加入蒸餾水，探究不同復(fù)合酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)毛竹筍殼多糖得率的影響，提取工藝按照1.3.2 所述。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken原理設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，三因素分別為復(fù)合酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度，以多糖得率為響應(yīng)指標(biāo)，確定復(fù)合酶法提取筍殼多糖的 最佳工藝。各因素及水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface test

1.3.6 毛竹筍殼多糖初步純化

將筍殼粗多糖配成1.5 mg/mL 的溶液，加入等體積的Sevag 試劑（氯仿 ∶ 正丁醇 = 4 ∶ 1）充分振搖20 min 后，4 000 r/min 離心10 min，棄去下層有機(jī)相，上層水相繼續(xù)進(jìn)行上述脫蛋白操作，重復(fù)4～5 次，直至無(wú)明顯的白色沉淀產(chǎn)生[13]。最后收集水相于透析袋（4～6k Da）中，透析2 d 后凍干得到筍殼精制多糖。

1.3.7 毛竹筍殼多糖的單糖組成分析

筍殼多糖的單糖組成采用柱前衍生化反相高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析鑒定[14]。測(cè)定條件：檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；柱溫30 ℃；柱子APS–2 HYPERSIL（4.6×250 mm，5 μm，Thermo，ΜSA）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相乙腈 ∶流動(dòng)相磷酸緩沖液（0.05 M ，pH6.8）=17 ∶ 83[15]。

1.3.8 毛竹筍殼多糖抗氧化活性測(cè)定

用蒸餾水配置不同濃度的筍殼多糖待測(cè)溶液，取待測(cè)溶液1.0 mL 置于試管中，再添加3.0 mL溶于95%乙醇的DPPH 溶液（0.075 mmol/L ），均勻混合，黑暗處放置30 min 后，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)吸光值，Vc 溶液為陽(yáng)性對(duì)照[16]。DPPH 自由基清除率的計(jì)算式為

式中：A0為空白樣品的吸光值；A1為樣品溶液的吸光值；A2為以蒸餾水代替DPPH 的吸光值。

羥自由基清除率的測(cè)定參考祁小妮等[13]、Mao等[17]的方法稍作修改。取2.0 mL 不同濃度的筍殼多糖待測(cè)溶液與2.0 mL FeSO4溶液（9.0 mmol/L）混勻，加入2 mL H2O2溶液（8.8 mmol/L ），搖勻，加入2.0 mL 水楊酸乙醇液（9.0 mmol/L），振蕩混勻后立刻在37 ℃水浴鍋中放置30 min，測(cè)定不同質(zhì)量濃度多糖樣品液在波長(zhǎng)510 nm 處的吸光值，Vc 溶液為陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基的清除率計(jì)算同式（2），其中A2為不加顯色劑H2O2的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取10 g 粉碎的毛竹筍殼，按照1 ∶ 30（m/V）料液比添加蒸餾水，提取溫度為50 ℃，分別添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的復(fù)合酶，酶解60 min，比較復(fù)合酶不同的添加量對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 酶添加量對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on the extraction rate of polysaccharide

由圖1 可以看出，隨著酶添加量的增加，多糖得率逐漸增加；當(dāng)添加量達(dá)到1.5%后，繼續(xù)增大添加量，多糖得率沒有顯著增加，這可能是在一定提取濃度下，酶濃度已經(jīng)趨于飽和，多糖幾乎全部溶出，繼續(xù)增加酶用量，對(duì)多糖得率沒有顯著影響。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選取1.5%作為適宜的復(fù)合酶添加量。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取10 g 粉碎的毛竹筍殼，按照1 ∶30（m/V）料液比添加蒸餾水，提取溫度為50 ℃，復(fù)合酶添加量為1.5%，分別酶解30，60，90，120，150 min，探究酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖2 所示。當(dāng)酶解時(shí)間小于90 min 時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率逐漸增加，且增加速率較大；當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)90 min 后，多糖得率不再增加，反而出現(xiàn)較小程度的下降，這可能是酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，少部分多糖出現(xiàn)了分解現(xiàn)象，同時(shí)酶的催化活性會(huì)降低，不能繼續(xù)增大多糖得率。因此 ，選取90 min 作為適宜的酶解時(shí)間。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic time on the extraction rate of polysaccharide

2.1.3 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取10 g 粉碎的毛竹筍殼，按照1 ∶30（m/V）料液比添加蒸餾水，添加1.5%的復(fù)合酶，分別在30，40，50，60，70 ℃條件下酶解90 min，探究酶解溫度對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)酶解溫度在30～50 ℃范圍內(nèi)，多糖得率逐漸上升，在50 ℃時(shí)多糖得率達(dá)到最高；溫度高于50 ℃后，多糖得率隨著溫度升高呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，這種現(xiàn)象可能是由于酶本身的特性引起的，酶具有最適反應(yīng)溫度，溫度過(guò)低會(huì)抑制其活性，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致其失去活性。因此，確定 出適宜的酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic temperature on the extraction rateof polysaccharide

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)響應(yīng)面法，對(duì)復(fù)合酶添加量A、酶解時(shí)間B、酶解溫度C 3 個(gè)單因素進(jìn)行分析，得到的試驗(yàn)方案及數(shù)據(jù)結(jié)果見表2，共有17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中5 個(gè)中心點(diǎn)試驗(yàn)。利用Design-Expert 軟件對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多糖得率Y 的二次回歸擬合曲線方程為

模型的方差與顯著性分析結(jié)果如表3 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface test

表3 回歸方程的方差分析Tab.3 Variance analysis of the regression equation

可以看出，該模型概率值P < 0.000 1，說(shuō)明該模型極顯著；失擬項(xiàng)不顯著（P = 0.735 3），說(shuō)明外界未知因素對(duì)試驗(yàn)的干擾較小；模型決定系數(shù)R2= 0.978 3，調(diào)整決定系數(shù)= 0.950 5，表示該響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)比較合理，建立的模型能夠解釋95.05%響應(yīng)值的變化，說(shuō)明毛竹筍殼多糖得率的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值能夠較好擬合，試驗(yàn)誤差較小，可以用此模型對(duì)復(fù)合酶法提取毛竹筍殼多糖的工藝條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[18]。比較F 值大小可以發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)多糖提取效果的影響程度順序?yàn)閺?fù)合酶添加量>酶解時(shí)間>酶解溫度，且在本研究所選取的因素水平范圍內(nèi)，3 個(gè)單因素對(duì)多糖得率均有極顯著的影響。

2.2.2 兩因素交互作用分析

復(fù)合酶法提取毛竹筍殼多糖工藝中酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度之間的交互作用對(duì)多糖得率的影響結(jié)果如圖4 所示。一般來(lái)講，響應(yīng)曲面圖的拋物面開口向下，說(shuō)明具有極大值點(diǎn)；響應(yīng)曲面圖的陡緩及其等高線圖的形狀可以反映因素兩兩交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，曲面越陡且等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，反之則說(shuō)明交互作用不顯著[13,19]。 從圖4 中可以看出，固定任意1 個(gè)因素為零水平，改變其余2 個(gè)因素時(shí)，隨著二者水平的提高，多糖得率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。相比較而言，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率下降的幅度較小，說(shuō)明酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響不顯著。因素A 與B，A 與C 交互作用的曲面圖較為陡峭，且等高線呈密集的橢圓形，表明酶添加量和酶解時(shí)間、酶添加量和酶解溫度之間均有較強(qiáng)的交互作用；因素B 與C 交互作用的曲面圖較緩，等高線趨向圓形，表明酶解時(shí)間與酶解溫度之間的交互作用不顯著。以上結(jié)果與方差分析結(jié)果基本一致。

圖4 各因素交互作用對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of the interaction between various factors on the extraction rate of polysaccharide

2.2.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design Expert 7.0 軟件對(duì)復(fù)合酶法提取毛竹筍殼多糖的最佳工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：復(fù)合酶添加量1.6%，酶解時(shí)間104.30 min，酶解溫度51.29 ℃。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化筍殼多糖提取工藝的可靠性，考慮到實(shí)際操作的可行性，調(diào)整參數(shù)為復(fù)合酶添加量1.6%，酶解時(shí)間105 min，酶解溫度51 ℃，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該調(diào)整工藝條件下多糖得率為1.98%，與模型預(yù)測(cè)值沒有明顯差異，相對(duì)誤差為2.94%。這說(shuō)明本次研究建立的響應(yīng)面模型得到的最優(yōu)工藝參數(shù)準(zhǔn)確性較強(qiáng)。

2.3 筍殼精制多糖的單糖組成

采用HPLC 測(cè)定筍殼精制多糖水解產(chǎn)物及10 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)比較10 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品衍生物在色譜圖中的保留時(shí)間和峰面積，分析確定單糖組成，以及各單糖組成的摩爾比，結(jié)果如圖5 所示。筍殼多糖能夠在上述色譜條件下得到有效的分離，其中，Man 為甘露糖；Rib 為核糖；Rham 為鼠李糖；GlcUA 為葡萄糖醛酸；GalUA 為半乳糖醛酸；Glc 為葡萄糖； Gal 為半乳糖；Xyl 為木糖；Ara 為阿拉伯糖；Fuc 為巖藻糖。根據(jù)色譜圖中的保留時(shí)間與峰面積，可以確定該多糖含有GalUA，Gal，GlcUA，Xyl，Ara 和Glc。其中，Glc 和GlcUA 的含量較低，主要單糖組 分GalUA，Gal，Xyl，Ara 的 摩爾 比為15.35 ∶32.82 ∶ 6.45 ∶ 39.13，可見毛竹筍殼多糖是一種酸性多糖。

圖5 筍殼多糖的單糖組成分析Fig.5 Analysis of the monosaccharide composition of thepolysaccharide

2.4 抗氧化活性結(jié)果與分析

2.4.1 DPPH 自由基清除率

毛竹筍殼精制多糖和Vc 對(duì)DPPH 自由基的清除效果比較如圖6 所示。可以看出，毛竹筍殼精制多糖具有顯著的清除DPPH 自由基的能力，且隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強(qiáng)；但是Vc清除DPPH 自由基的效果基本保持穩(wěn)定。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL 時(shí)，精制多糖對(duì)DPPH 的清除率已達(dá)到50%以上，但Vc 對(duì)DPPH 的清除率已高達(dá)96.67%。精制多糖的半抑制濃度IC50值為0.47 mg/mL，可見一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的Vc 和筍殼多糖對(duì)DPPH 自由基都具有一定的清除效果，且毛竹筍殼精制多糖對(duì)DPPH 的清除效果較低于相 同濃度條件下的Vc。

圖6 筍殼多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.6 DPPH scavenging rate of the purified polysaccharide

2.4.2 羥自由基清除率

筍殼精制多糖和Vc 對(duì)羥自由基的清除效果比較 結(jié)果如圖7 所示。

圖7 筍殼多糖對(duì)羥自由基的清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging rate of the purified polysaccharide

由圖7 可知，在質(zhì)量濃度低于2.0 mg/mL 范圍內(nèi)，二者對(duì)羥自由基的清除能力隨濃度的增大而增大，Vc 清除效果增大的速度較快；當(dāng)多糖、Vc 質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，Vc 對(duì)羥自由基的清除效果基本保持穩(wěn)定，已達(dá)到最大值；精制多糖對(duì)羥自由基的清除率為33.42%，且隨著濃度的增大，清除效果持續(xù)提高。筍殼精制多糖和Vc 對(duì)羥自由基的半抑制濃度IC50值分別為4.00，0.35 mg/mL。綜上分析可以看出，筍殼精制多糖對(duì)羥自由基的清除效果稍弱，且呈現(xiàn)出較明顯的質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。

3 結(jié) 論

選用復(fù)合酶法提取毛竹筍殼的多糖，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)Design-Expert 軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，并建立了數(shù)學(xué)模型，獲得了筍殼多糖的最佳提取工藝條件：復(fù)合酶添加量1.6%，酶解時(shí)間105 min，酶解溫度51 ℃。在最優(yōu)條件下的多糖得率為1.98%，與模型預(yù)測(cè)值基本吻合。通過(guò)高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，筍殼精制多糖是一種酸性多糖，主要單糖組分半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的摩爾比為15.35 ∶32.82 ∶ 6.45 ∶ 39.13?？寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果表明，毛竹筍殼多糖具有一定的DPPH 自由基和羥自由基清除能力，其清除能力與多糖的質(zhì)量濃度有明顯的量效關(guān)系。