韋云瑩，王立峰，熊智強(qiáng)，王世杰，趙林森，艾連中

（1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.南京財經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210046；3.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221；4.河北一然生物科技有限公司，石家莊 050800）

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L. Lactic）是被公認(rèn)為安全的食品級微生物，具有較強(qiáng)的分解蛋白和產(chǎn)酸能力，能夠抑制葡萄球菌、球菌和芽孢桿菌等微生物，所以被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)[1-2]。作為益生菌，乳酸乳球菌不僅可以維持腸道菌群平衡，還可以刺激腸道免疫組織分泌免疫因子，從而提高機(jī)體免疫力[3]。乳酸乳球菌是乳酸菌屬中一種重要的模式菌，具有生長迅速快、代謝相對簡單、基因組小、操作容易和安全性高等特點[4]。此外，由于乳酸乳球菌抗原性較弱，自身蛋白分泌少，不在腸道中定值[5]，不僅不會引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答和干擾目的蛋白的表達(dá)，還可以避免產(chǎn)生免疫耐受性。這些優(yōu)點使得乳酸乳球菌成為食品級表達(dá)宿主的最佳選擇[6]。近年來，利用分子生物學(xué)手段可以對乳酸乳球菌的生物學(xué)特性進(jìn)行改造，使得乳酸乳球菌不僅可以用于乳制品的制備，提高食品的營養(yǎng)價值，還可以用于抗原的生產(chǎn)和人類疾病的治療[7-8]。

乳酸乳球菌NZ9000 是乳酸菌中調(diào)控基因表達(dá)使用最廣泛的一種宿主菌株[9]，在食品和藥品等工業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景，因此獲得高效的電轉(zhuǎn)化效率至關(guān)重要。本研究首先單因素優(yōu)化了乳酸乳球菌的電轉(zhuǎn)化方法，接著利用響應(yīng)面法對影響電轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素進(jìn)一步優(yōu)化，為發(fā)掘乳酸乳球菌感受態(tài)潛力奠定基礎(chǔ)，為提高乳酸乳球菌感受態(tài)效率提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒

試驗所用的質(zhì)粒pNZ44 為乳桿菌穿梭質(zhì)粒。

1.1.2 培養(yǎng)基

GM17 培養(yǎng)基：用于乳酸乳球菌NZ9000 的活化、培養(yǎng)和活菌計數(shù)。配方為：胰蛋白胨5 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、牛肉膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、酵母浸出粉2.5 g/L、β?磷酸甘油二鈉19 g/L、維生素C 0.5 g/L、MgSO40.25 g/L。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉20 g/L。

復(fù)蘇培養(yǎng)基I：GM17 液體培養(yǎng)基。

復(fù)蘇培養(yǎng)基II：含有CaCl22 mmol/L 和 MgCl220 mmol/L 的GM17 液體培養(yǎng)基。

復(fù)蘇培養(yǎng)基III：含有蔗糖0.5 mol/L，CaCl22 mmol/L 和 MgCl220 mmol/L 的GM17 液 體 培養(yǎng)基。

復(fù)蘇培養(yǎng)基IV：含有山梨醇0.5 mol/L，CaCl22 mmol/L 和MgCl220 mmol/L 的GM17 液 體 培養(yǎng)基。

大腸桿菌（LB）培養(yǎng)基：用于大腸桿菌的培養(yǎng)。配方為：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L。121℃滅菌15 min。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉20 g/L。

1.1.3 洗滌緩沖液溶液I：體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油、蔗糖0.5 mol/L。溶液II：體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油、蔗糖0.5 mol/L和乙二胺四乙酸（EDTA）0.05 mol/L 。

溶液III：乙酸鋰二水100 mmol/L、二硫蘇糖醇（DTT）10 mmol/L、蔗 糖0.6 mol/L、pH7.5 的

Tris-HCl 1 mol/L。

1.1.4 儀器與試劑

質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen； Nanodrop 2000c 購 自Thermo 公 司； 冷 凍 離 心 機(jī) 購 自Sigma 公司；厭氧培養(yǎng)箱購自Ruskinn 公司。

1.2 乳酸乳球菌NZ9000 感受態(tài)制備方法

挑取平板劃線后的單菌落至5 mL GM17 液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)12～16 h；5%接種至50 mL GM17 液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)12～16 h；8%接種至含有0.5 mol/L 蔗糖和25 g/L 甘氨酸的GM17 液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)至吸光值OD600為0.3～0.4，離心棄上清，溶液III 重懸細(xì)胞，室溫靜置30 min，離心棄上清，先用溶液I 洗滌細(xì)胞，再用溶液II 洗滌，最后重懸于溶液I 中。每管100 μL 保存至?80℃，電轉(zhuǎn)化備用。以上所有離心條件均為4℃，6 000 r/min，10 min[10]。

1.3 乳酸乳球菌NZ9000 感受態(tài)效率檢測

取一定量質(zhì)粒與100 μL 感受態(tài)細(xì)胞混勻，迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷無菌的2 mm 的電轉(zhuǎn)杯中，設(shè)置好電轉(zhuǎn)參數(shù)后進(jìn)行電擊。電擊完畢后，立即加入900 μL液體復(fù)蘇培養(yǎng)基，并在30℃靜置保溫2～3 h，然后取100 μL 涂布于抗性平板，30℃靜置培養(yǎng)24～48 h 后，觀察并記錄轉(zhuǎn)化子個數(shù)。

以上試驗均重復(fù)做3 次。根據(jù)加入質(zhì)粒的量，計算每μg 質(zhì)粒所得轉(zhuǎn)化子的數(shù)目即為電轉(zhuǎn)化效率，其公式如下：

1.4 單因素試驗

將液體活化后的菌液接種至含有25 g/L 甘氨酸和0.5 mol/L 蔗糖的GM17 培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)至OD600為0.2，0.4，0.6，0.8 收集菌體并制備感受態(tài)。其他步驟不改變的情況下，比較電轉(zhuǎn)化效率，尋找合適生長階段。

在獲得最優(yōu)OD600的情況下，將液體活化后的菌液分別接種至含有甘氨酸濃度5，10，15，20，25 g/L 和蔗糖0.5 mol/L 的GM17 培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞并制備感受態(tài)。其他步驟不變的情況下，比較電轉(zhuǎn)化效率，找到合適的甘氨酸濃度。

在獲得上述最優(yōu)條件的情況下制備感受態(tài)，分 別 將50，200，500，800，1 100 ng 的pNZ44質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到乳酸乳球菌NZ9000 感受態(tài)中，觀察不同質(zhì)粒濃度對電轉(zhuǎn)化效率的影響，找到最佳質(zhì)粒濃度。

將制備好的感受態(tài)，分別在電場強(qiáng)度為7.5，10，12.5，15 kV/cm 下電擊轉(zhuǎn)化，比較電轉(zhuǎn)化效率，獲得最優(yōu)電場強(qiáng)度。

在獲得上述最優(yōu)條件的情況下，比較不同復(fù)蘇培養(yǎng)基I，II，III，IV 對電轉(zhuǎn)化效率的影響，確定最佳復(fù)蘇培養(yǎng)基。

在獲得上述最優(yōu)條件的情況下，比較不同復(fù)蘇時間1，2，3，4，5，6 h 對電轉(zhuǎn)化效率的影響，確定復(fù)蘇時間。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計法，對乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化條件的關(guān)鍵因素作進(jìn)一步研究和探討，以獲得其最佳電轉(zhuǎn)化效率。Box-Behnken 試驗設(shè)計見表1。其中，A，B，C 分別表示甘氨酸濃度、吸光值和電場強(qiáng) 度。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗因素和水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken test

2 結(jié)果與討論

與乳酸乳球菌商業(yè)化感受態(tài)制備的過程相比，本課題組前期借鑒Papagianni 等[11]預(yù)處理細(xì)胞的方法，使用乙酸鋰二水和DTT 處理細(xì)胞[10]，電轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1.5×107CFU/μg DNA。但是使用含有甘氨酸濃度25 g/L 和蔗糖0.5 mol/L 的GM17 培養(yǎng)細(xì)胞，由于高濃度甘氨酸對細(xì)胞生長壓力大，細(xì)胞生長緩慢，培養(yǎng)時間長，大大影響了試驗效率。在此基礎(chǔ)上，本研究對其電轉(zhuǎn)化條件展開優(yōu)化。

2.1 生長階段對電轉(zhuǎn)化效率的影響

目前關(guān)于乳酸菌電轉(zhuǎn)化的研究表明，不同生長階段的乳酸菌對電擊的敏感程度不同[12]。選取4 個生長階段的乳酸乳球菌NZ9000 制備成感受態(tài)并電轉(zhuǎn)化，其結(jié)果如圖1 所示。在細(xì)胞培養(yǎng)至OD600為0.4 左右時，電轉(zhuǎn)化效率最高，可達(dá)4.81×106CFU/μg DNA。相比于穩(wěn)定期的細(xì)胞，處于對數(shù)生長前期的細(xì)胞電轉(zhuǎn)化效率更好。這可能是因為該時期細(xì)胞活性較好，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相對疏松 ，有利于外源DNA 的進(jìn)入[13]。

圖1 生長階段對乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.1 Effect of growth phase on the electrotransformaion efficiency of L.lactis NZ9000

2.2 甘氨酸濃度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

乳酸乳球菌是革蘭氏陽性菌，其較厚的細(xì)胞壁是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。在培養(yǎng)基中添加一些細(xì)胞壁弱化劑有利于外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞。甘氨酸作為常見的細(xì)胞弱化劑，已經(jīng)廣泛用于乳酸菌感受態(tài)的制備。但是，甘氨酸濃度過高可能會抑制菌體的生長，引起細(xì)胞裂解[14]。因此，選擇合適濃度的甘氨酸至關(guān)重要。分別選取甘氨酸5，10，15，20，25 g/L 和蔗糖0.5 mol/L 的GM17 培養(yǎng)基，處理細(xì)胞至OD600約0.4 時制備感受態(tài)并電轉(zhuǎn)化，其結(jié)果如圖2 所示。在甘氨酸濃度為10 g/L時，電 轉(zhuǎn) 化 效 率 達(dá) 到 最 高，為2.17×107CFU/μg DNA，隨著甘氨酸的濃度升高，轉(zhuǎn)化效率反而下降 。這與楊涓等[15]的研究結(jié)果一致。

圖2 甘氨酸濃度對乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effect of glycine content on the electrotransformation efficiency of L.lactis NZ9000

2.3 質(zhì)粒濃度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

外源質(zhì)粒濃度會影響電轉(zhuǎn)化效率，當(dāng)細(xì)胞濃度一定時，添加不同濃度的外源質(zhì)粒得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)目不同。質(zhì)粒濃度過大，電轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的電阻較大，易于擊穿電轉(zhuǎn)杯[16]。本研究選擇添加不同濃度的pNZ44 質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，考察其對NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率的影響，其結(jié)果如圖3 所示。質(zhì)粒濃度在500 ng 左右時，電轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)2.89×107CFU/μg DNA。質(zhì)粒濃度再升高時，轉(zhuǎn)化效率反而下降。

圖3 質(zhì)粒濃度對乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effect of plasmid content on the electrotransformation efficiency of L.lactis NZ9000

2.4 電場強(qiáng)度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

電轉(zhuǎn)化的原理就是利用瞬時高壓電擊細(xì)胞膜形成孔洞，使DNA 分子進(jìn)入細(xì)胞[17]。電場強(qiáng)度過低時，細(xì)胞膜難以形成孔洞；場強(qiáng)過高又可能會損傷細(xì)胞膜，影響存活率。只有在合適的場強(qiáng)范圍內(nèi)，電場強(qiáng)度越強(qiáng)，細(xì)胞膜上產(chǎn)生的孔洞越多，通透性越好，這樣才更有利于外源DNA 分子的進(jìn)入[18]。電場強(qiáng)度對電轉(zhuǎn)化效率的影響如圖4 所示，乳酸乳球菌NZ9000 的電轉(zhuǎn)化效率在10 kV/cm 時達(dá)到最好，為2.95×107CFU/μg DNA。

圖4 電場強(qiáng)度對乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 Effect of electric filed strength on the electrotransformation efficiency of L.lactis NZ9000

2.5 復(fù)蘇培養(yǎng)基對電轉(zhuǎn)化效率的影響

研究表明，細(xì)胞電擊后很容易大量死亡。在培養(yǎng)基中添加一些物質(zhì)如蔗糖、山梨醇等可能會有利于細(xì)胞膜孔洞的復(fù)原[19]。選擇4 種培養(yǎng)基來復(fù)蘇電轉(zhuǎn)化后的NZ9000 細(xì)胞，結(jié)果如圖5 所示。在GM17 培養(yǎng)基中電轉(zhuǎn)化效率最低，而其他3 種培養(yǎng)基復(fù)蘇后轉(zhuǎn)化效率相差不大。復(fù)蘇培養(yǎng)基II 比復(fù)蘇培養(yǎng)基I 的轉(zhuǎn)化效率更高，可能是由于CaCl2和MgCl2的存在能夠促進(jìn)外源DNA 的吸收 ，獲得更多的轉(zhuǎn)化子。

圖5 復(fù)蘇培養(yǎng)基對乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 Effect of incubation medium on the electrotransformation efficiency of L.lactis NZ9000

2.6 復(fù)蘇時間對電轉(zhuǎn)化效率的影響

細(xì)胞電擊后一定的復(fù)蘇時間有利于抗性基因的表達(dá)[18]。相比于直接涂布抗性平板，電轉(zhuǎn)后先在不含抗生素的培養(yǎng)基中復(fù)蘇一段時間可以獲得更多轉(zhuǎn)化子。分別將電擊后的細(xì)胞復(fù)蘇1，2，3，4，5，6 h 涂布抗性平板，結(jié)果如圖6 所示。細(xì)胞復(fù)蘇時間為2h時電轉(zhuǎn)化效率較高，2h之后隨著復(fù)蘇時間的增加，電轉(zhuǎn)化效率變化不大。因此復(fù)蘇時間選擇2h為宜。

圖6 復(fù)蘇時間對乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.6 Effect of incubation time on the electrotransformation efficiency of L.lactis NZ9000

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化條件結(jié)果分析

通過單因素試驗可以發(fā)現(xiàn)生長階段、甘氨酸濃度和電場強(qiáng)度對電轉(zhuǎn)化效率的影響較為顯著，因此采用Box-Behnken 響應(yīng)面試驗對對甘氨酸濃度（A）、OD600（B）和電場強(qiáng)度（C）這3 個因素進(jìn)行優(yōu)化，得到的試驗方案和數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Box-Behnken test design and results

利用Design Expert 軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析及二次多項回歸擬合，得到乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率Y 對甘氨酸濃度、OD600和電場強(qiáng)度的多元回歸方程為

模型的方差和顯著性分析結(jié)果如表3 所示。可見，模型概率值P（<0.000 1）小于0.01，表明該模型極顯著，模型失擬項的P 值為0.674 4，大于0.05，所以該模型的擬合度較高。決定系數(shù)R2=0.982 0，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.958 9，說明此模型與實際擬合較好，誤差較小，可以用此模型對乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行預(yù)測。由回歸系數(shù)檢驗值F 可知，各因素對乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率的影響程度為：甘氨酸濃度>電場強(qiáng)度>OD600。3 個因素對響應(yīng)值都有極為顯著的影響；交互項BC 影響最顯著，其次分別是交互項AB 和AC；各因素的平方項對響應(yīng)值也都具有顯著影響，其中A2和B2的影響極顯著，說明各影響因素對電轉(zhuǎn)化效率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3 回歸方程模型顯著性分析Tab.3 Significance test for cofficients of the regression model developed

運(yùn)用Design Expert 軟件分析，得到乳酸乳球菌NZ9000 最優(yōu)電轉(zhuǎn)化條件為：電場強(qiáng)度12.5 kV/cm，OD6000.2，甘氨酸濃度7.77 g/L，預(yù)測在此條件下乳酸乳球菌 NZ9000 的電轉(zhuǎn)化率達(dá)到 3.8×107CFU/μg DNA。為了方便操作，將上述預(yù)測的參數(shù)修改為：電場強(qiáng)度12.5 kV/cm，OD6000.2，甘氨酸濃度8 g/L。按此電轉(zhuǎn)化條件得到乳酸乳球菌NZ9000 的電轉(zhuǎn)化效率為（3.76±0.26）×107CFU/μg DNA，與理論值非常接近。這說明條件參數(shù)可靠，能夠較好地預(yù)測乳酸乳球菌NZ9000 的電轉(zhuǎn)化效率。與目前報道相比，優(yōu)化后乳酸乳球菌NZ9000 的電轉(zhuǎn)化效率提高了250%，并且縮短了培養(yǎng)時間，提高了試驗效率。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗，對影響乳酸乳球菌NZ9000 電轉(zhuǎn)化效率的各因素：生長階段、甘氨酸濃度、質(zhì)粒濃度、電場強(qiáng)度、復(fù)蘇培養(yǎng)和復(fù)蘇時間進(jìn)行優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上建立了響應(yīng)面模型，確定出乳酸乳球菌NZ9000 的最佳電轉(zhuǎn)化條件，使電轉(zhuǎn)化效率高達(dá)3.76×107CFU/μg DNA。本研究不僅為提高電轉(zhuǎn)化效率提供了新思路，還促進(jìn)人們對乳酸乳球菌的感受態(tài)潛力進(jìn)行更深入的挖掘，以提高其工業(yè)性能和發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量。