李金娜，苗書魁，馬文戈，魏玉榮，汪 萍，夏 俊，陸桂麗，米曉云，沙依蘭·卡依扎，王 延，魏 婕，黃 炯

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所(新疆畜牧科學(xué)院動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心)，烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由FMDV引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸感染的傳染病[1]?？谔阋卟《拘投嘁鬃?，宿主譜廣，傳播途徑多，自然康復(fù)動物長期排毒，同群動物發(fā)病即撲殺處置，導(dǎo)致經(jīng)濟損失巨大、政治影響嚴重。因此，OIE將其規(guī)定為法定報告的傳染病，我國將其列為一類動物傳染病[2]。FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，基因組為單股正鏈RNA，RNA分子位于衣殼內(nèi)，約有8 500個核苷酸(nucleotide，nt)?；蚪M5'端共價連接著一個病毒編碼的小蛋白質(zhì)(VPg)，緊接著依次由5'非翻譯區(qū)(Untranslated region，UTR)、開放閱讀框(Open reading fragment，ORF)、3'UTR和Poly(A)組成。試驗用普通PCR法和3'RACE法擴增3'端序列，對FMDV反向遺傳學(xué)研究有實際意義。【前人研究進展】FMDV全基因組序列的擴增已有很多報道，其中選用最多的擴增方法為普通PCR方法[3-10]，這些學(xué)者先提取FMDV的RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，再以cDNA為模板，利用設(shè)計的多對引物分別進行普通PCR，將擴增產(chǎn)物測序，最后拼接得到病毒全基因組序列。Arzt J等[11]將FMDV全基因組設(shè)計為5'UTR、ORF和3'UTR三個相互重疊的片段，提取病毒RNA后，采用RT-PCR獲得了FMDV全基因組序列?！颈狙芯壳腥朦c】有關(guān)FMDV同一毒株不同亞克隆之間Poly(A)長度的研究尚未見報道。研究口蹄疫病毒基因組3'末端序列擴增?！緮M解決的關(guān)鍵問題】試驗采用普通PCR法和3'RACE法對FMDV基因組3'末端進行擴增，對3'UTR序列進行分析，比較Poly(A)長度的不同，為FMDV 3'端序列的擴增、FMDV結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因組結(jié)構(gòu)、感染性克隆構(gòu)建、致病機理和毒力變異機制等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒基因組RNA和細胞

口蹄疫病毒O/Akesu/58 CE39A是1958年采集自新疆阿克蘇地區(qū)的牦?？谔阋逴型病毒，經(jīng)過雞胚適應(yīng)傳代39代次馴化致弱，再篩選獲得的克隆毒株A?；蚪MRNA自1990年代由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存于液氮中。BHK-21細胞由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。感受態(tài)大腸埃希菌DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Cat.Not.04896866001)購自Roche公司，PrimeSTAR DNA聚合酶購自TaKaRa公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中O型口蹄疫參考序列(GenBank登錄號：EF552696)，在病毒全基因組3'端設(shè)計1對引物及3'RACE引物，由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司合成。表1

表1 3'端序列擴增引物
Table 1 Primers for amplification of the 3'-end sequences

引物Primer位置Position序列Sequence(5'→3')Poly(A)長度The length of Poly(A)1F7 987TCTGGACCTGACGAGTACCG1R3'末端TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT23/24/25/27/29/43Gene Specific Outer Primer7 614TCTACGTGCTCTACGCCTTGGene Specific Inner Primer7 642CTATGAGGGGGTTGAGCTGGAC19

1.2 方 法

1.2.1 RNA純度測定

取液氮中保存的FMDV O/Akesu/58 CE39A RNA 10 μL，加990 μL ddH2O,混勻，于紫外分光光度計測定其核酸純度。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄

將保存的口蹄疫病毒O/Akesu/58 CE39A RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作過程按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說明書操作，反轉(zhuǎn)錄引物選用Oligo (dT)18。

1.2.3 3'末端序列擴增

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，以普通PCR(引物1F/1R)和3'RACE法分別對O/Akesu/58 CE39A毒株全基因組3'端序列進行擴增。所用引物見表1。

普通PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s進行25個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

3'RACE法Outer PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；再以94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s進行25個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

3'RACE法Inner PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；再以94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s進行25個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

各取5 μL PCR產(chǎn)物，以1%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.4 目的片段的克隆與鑒定

將普通PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體(標記為：pMD19-T-1)，將3'RACE法Inner PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體(標記為：pMD19-T-3)，分別轉(zhuǎn)化DH5α，挑單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒pMD19-T-1和pMD19-T-3均用Xba I和Sal I雙酶切鑒定，各選7個陽性質(zhì)粒送新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.5 3'UTR序列分析

用DNAStar、DNAMAN等軟件對病毒全基因組3'UTR序列進行分析，并與參考毒株的序列進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA純度測定

以分光光度計測得O/Akesu/58 CE39A株基因組RNA A260/A280為1.871，此RNA中可能有部分蛋白質(zhì)或其它有機物的污染，或是完整RNA降解導(dǎo)致純度降低，但在允許范圍1.8～2.0之內(nèi)。

2.2 3'端序列擴增

普通PCR法擴增出了目的條帶，3'RACE法也擴增出了目的條帶。圖1

注：M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1，普通PCR法擴增的目的條帶(237 bp)；3，3'RACE法擴增的目的條帶(597 bp)

Note: M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1，The target bands amplified by general PCR(237 bp)；3，The target bands amplified by 3'RACE(597 bp)

圖1 3' 端序列擴增
Fig.1 Amplification of 3'-end sequences

2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將質(zhì)粒pMD19-T-1和pMD19-T-3均用Xba I和Sal I雙酶切后，以1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均得到預(yù)期大小的兩條帶。質(zhì)粒pMD19-T-1的兩條帶為：2 680 bp(pMD19-T載體)+249 bp(片段)(圖2，1)，質(zhì)粒pMD19-T-3的兩條帶為：2 680 bp(pMD19-T載體)+641 bp(片段)(圖2，3)，說明得到的2個質(zhì)粒均為陽性質(zhì)粒。圖2

2.4 3'UTR序列

用3'RACE法擴增的3'端序列大小為565 bp，包括部分非結(jié)構(gòu)蛋白(3D)基因以及緊接著3D基因下游的3'UTR和Poly(A)尾，3'UTR長度為98 nt，Poly(A)長度為19 nt。3'UTR序列從終止密碼子UAA到3'端Poly(A)有98 nt(8 101～8 198 nt)。用DNAMAN軟件分析3'UTR序列，顯示其二級結(jié)構(gòu)含有2個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分別位于8 101～8 140和8 146～8 190 nt。

用DNAStar、DNAMAN等軟件對O/Akesu/58 CE39A株3'UTR序列與參考毒株的3'UTR序列進行比對。研究表明，O/Akesu/58 CE39A株與參考毒株O/MAY/3/2014(GenBank登錄號：KY322672)和O/IND26(54)/2014(GenBank登錄號：KJ825807)的核苷酸序列同源性最高，均為89.8%。

注：M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：pMD19-T-1酶切產(chǎn)物(2 680 bp+249 bp)；3：pMD19-T-3酶切產(chǎn)物(2 680 bp+641 bp)

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The products from pMD19-T-1 (2 680 bp+249 bp); 3: The products from pMD19-T-3 (2 680 bp+641 bp)

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定
Fig.2 Restriction endonuclease digestion identification of recombinant plasmid

2.5 Poly(A)長度

以普通PCR擴增，將得到的多個亞克隆測序，其Poly(A)數(shù)量為23、24、25、27、29、43；以3'RACE法擴增，測得亞克隆的Poly(A)數(shù)量為19，說明不同擴增方法獲得的亞克隆之間Poly(A)長度存在差異。普通PCR和3'RACE法擴增后測得Poly(A)數(shù)量差異的可能原因是，3'RACE法擴增時，試劑盒引物中Poly(T)數(shù)量可能為19，擴增后Poly(A)數(shù)量為19。而普通PCR的6個亞克隆測得Poly(A)數(shù)量不同，可能原因為，第一，RNA質(zhì)量的影響。FMDV RNA為單鏈結(jié)構(gòu)，容易斷裂，所提取的RNA中有斷裂的RNA，反轉(zhuǎn)錄后cDNA中Poly(A) 長度不同；第二，F(xiàn)MDV RNA長約8 500 nt，基因組長，末端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，反轉(zhuǎn)錄時，反轉(zhuǎn)錄引物與模板配對的位置不同，則反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中Poly(A)長度不同。第三，上述2個原因?qū)е路崔D(zhuǎn)錄產(chǎn)物為全長cDNA和非全長cDNA的混合物，即模板為含不同長度Poly(A)的大量cDNA混合物。進行PCR時，即使模板中Poly(A) 長度相同，但由于下游引物與模板配對是隨機的，下游引物與模板結(jié)合的位置不同，則擴增的片段中Poly(A)的長度有所不同。況且模板為含不同長度Poly(A)的cDNA混合物，擴增后片段中Poly(A)的長度肯定不同。圖3

圖3 不同長度的Poly(A)
Fig.3 The different lengths of the Poly(A)

3 討 論

FMDV 3'UTR和Poly(A)在病毒復(fù)制中起著至關(guān)重要的作用，其特性和作用并不是很明確。Poly(A)與3'UTR共價相連，可能是病毒有效復(fù)制或翻譯所必需的結(jié)構(gòu)[13]。Poly (A)與病毒毒力有關(guān)，Poly (A)長度與病毒毒力的具體關(guān)系尚未定論。為了確定3'UTR和Poly(A) 的作用，需要先對這段序列進行擴增。因此，對3'端序列的擴增顯得尤為重要。但FMDV基因組3'端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難于擴增。計算機分析發(fā)現(xiàn)FMDV China/99的3'端為一個類似三葉草的二級結(jié)構(gòu)[14]，研究顯示O/Akesu/58 CE39A株的3'UTR含有2個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與有的學(xué)者[15-16]報道的一致。3'UTR的一部分位于非結(jié)構(gòu)蛋白3D編碼區(qū)之后，長約100 nt，能形成特殊的高級結(jié)構(gòu)[17]，小RNA病毒基因組包括一個Poly (A)區(qū)段，該區(qū)段可以折疊成特殊結(jié)構(gòu)[18]。上述特殊結(jié)構(gòu)均增加了3'端序列擴增的難度，尤其是Poly(A)的擴增。試驗采用普通PCR法和3'RACE法均擴增出了FMDV 3'端序列，為3'UTR和Poly(A)作用的研究奠定了基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)FMDV Poly(A) 的長度不同。Chatterjee N K等[19]認為FMDV基因組3'末端Poly(A)尾長達60～80 nt。劉光清等[12]采用3'RACE法克隆得到的Poly(A)長度為56 nt。試驗測得Poly(A)數(shù)量為19、23、24、25、27、29、43，說明同一毒株的亞克隆，其Poly(A) 長度與基因擴增時所用方法有關(guān)。通常Poly(A)要么擴增成功后其長度不同，要么擴增失敗，失敗的原因可能是3'末端結(jié)構(gòu)復(fù)雜。將GenBank中部分FMDV的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)有的序列具有Poly(A)[如(登錄號：AB079061)、(登錄號：AF308157)、(登錄號：AJ633821)、(登錄號：EF552696) 、(登錄號：AY593811)和(登錄號：HM008917)等]，而有的序列沒有Poly(A)[如(登錄號：AJ539138)、(登錄號：AJ539140)、(登錄號：AY312589)、(登錄號：AH012984) 、(登錄號： KJ825804)和(登錄號： KJ825802)]。沒有Poly(A)的原因可能是研究者與筆者擴增的結(jié)果類似，不同亞克隆獲得的Poly(A)長度有差異，由于沒有確切的長度故而登錄時省略；也有可能是試驗中未擴增出來，若如此，則要采用不同方法進行多次擴增，以得到Poly(A)。

目前，對Poly(A)尾功能的報道較少，且說法不一，其具體功能仍處于探索階段。Poly(A)尾在基因組復(fù)制方面起著重要作用。Poly (A)的存在能使FMDV轉(zhuǎn)錄及時有效地終止[20]。Poly(A)不但具有穩(wěn)定病毒基因組結(jié)構(gòu)的功能，而且對維持其感染性也有一定的作用[21]。Poly(A)的長度與感染性的關(guān)系一直存在爭議。認為Poly(A)的長度越長越好，也有人認為O型FMDV Poly (A)的長度與病毒感染性之間的關(guān)系很小或沒有相關(guān)性[21-22]；與此相反，C型Poly (A)序列10 nt與40 nt之間的感染性差異在5～16倍，與PV、EMCV、SV等病毒相似[11，21]。苗書魁等[23]認為Poly(A)長度與感染性的關(guān)系不是確定的，不是越長越好，或越短越好，而是依毒株而定。因此，通過對FMDV 3'端序列的擴增，為3'UTR和Poly (A)長度的研究，為病毒復(fù)制、FMDV結(jié)構(gòu)與功能的研究、Poly(A)長度與感染性關(guān)系、感染性克隆構(gòu)建、致病機理和毒力變異機制等提供參考。

4 結(jié) 論

4.1 普通PCR法和3'RACE法均可擴增出FMDV基因組3'末端序列。用3'RACE法擴增的3'端序列大小為565 bp，包括部分非結(jié)構(gòu)蛋白(3D)基因以及緊接著3D基因下游的3'UTR和Poly( A)尾，3'UTR長度為98 nt(8 101～8 198 nt)，Poly(A)長度為19 nt。用DNAMAN軟件分析3'UTR序列，顯示其二級結(jié)構(gòu)含有2個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分別位于8 101～8 140和8 146～8 190 nt。

4.2 測得FMDV Poly(A)數(shù)量為19、23、24、25、27、29、43，說明同一毒株的亞克隆，其Poly(A) 長度與基因擴增時所用方法有關(guān)。據(jù)此推測，不同毒株的Poly(A)長度不同，可能是毒株本身屬性，也有可能是由擴增方法不同造成。

4.3 Poly(A)要么擴增成功后其長度不同，要么擴增失敗，失敗的原因可能是3'末端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難于擴增。

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