田克強(qiáng) 羅克勍 謝鋆暉 肖富福

[摘要]目的 探討膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、雄激素受體（AR）、波形蛋白（VIM）在腦膠質(zhì)惡性腫瘤中的表達(dá)及與患者預(yù)后的相關(guān)性。方法 選取2014年1月～2016年12月我院收治的40例腦惡性膠質(zhì)瘤患者手術(shù)標(biāo)本，采用免疫組化檢測GFAP、AR、VIM的表達(dá)并分析其臨床意義；比較分析癌癥和腫瘤基因圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中腦惡性膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)GFAP、AR、VIM表達(dá)及其預(yù)后相關(guān)性。結(jié)果 隨著腦膠質(zhì)瘤病理級別的升高，AR、GFAP、VIM表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。GFAP、AR、VIM在腦惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)均顯著高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。AR、VIM表達(dá)水平均顯著影響腦惡性膠質(zhì)瘤患者的總生存期（OS）；GFAP表達(dá)水平對患者的OS無影響（P>0.05）。AR表達(dá)與VIM表達(dá)成中等正相關(guān)（r=0.641，P=0.000），AR表達(dá)與GFAP表達(dá)成中等正相關(guān)（r=0.533，P=0.000），GFAP表達(dá)與VIM表達(dá)無明顯相關(guān)性（r=-0.007，P>0.05）。結(jié)論 GFAP、AR及VIM高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，AR與VIM表達(dá)水平可作為腦膠質(zhì)惡性瘤預(yù)后的有效指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]腦膠質(zhì)瘤；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；雄激素受體；波形蛋白

[中圖分類號] R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）12（a）-0070-04

腦惡性膠質(zhì)瘤是最常見的神經(jīng)中樞系統(tǒng)腫瘤，呈侵襲性生長，手術(shù)難以切盡，且對放化療不敏感，具有復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差、死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著人類生命健康[1]。如何尋找到惡性腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后標(biāo)記及有效治療措施一直是臨床研究的熱點(diǎn)之一。雄激素受體（androgen receptor，AR）通過雄激素依賴或非依賴的方式發(fā)揮作用，抑制部分抑癌蛋白的功能，或促進(jìn)部分腫瘤蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的特異性中間絲結(jié)構(gòu)蛋白，在維持星形細(xì)胞形態(tài)、決定細(xì)胞分化和細(xì)胞功能方面具有關(guān)鍵作用[2]。波形蛋白（vimentin，VIM）是重要的細(xì)胞骨架蛋白之一，屬于中間纖維的波形纖維蛋白類，主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。本研究擬通過檢測腦惡性膠質(zhì)瘤中AR、GFAP和VIM表達(dá)，探討三者的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年1月～2016年12月我院收治的40例腦惡性膠質(zhì)瘤患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織均有明確病理結(jié)果；臨床資料完整；手術(shù)前未進(jìn)行任何放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理不明確或混有其他病理組織類型；有重大免疫性疾病史；合并有其他腫瘤病史者；危重患者。其中，男25例，女15例；年齡37～62歲，平均（49.30±11.40）歲。根據(jù)WHO 2007中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類及分級：WHO Ⅰ級10例，WHO Ⅱ級8例，WHO Ⅲ級13例，WHO Ⅳ級9例。所有患者均已簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2研究方法

1.2.1主要試劑 小鼠抗人AR單克隆抗體（美國Affinity公司，BF0 418）；兔抗人GFAP單克隆抗體（美國Affinity公司，BF0345）；小鼠抗人VIM單克隆抗體（美國Affinity公司，DF7035）；免疫組化試劑盒（上海QYBIO公司，qy-m001）。

1.2.2免疫組化染色 免疫組化法檢測AR、GFAP及VIM蛋白表達(dá)。首先將標(biāo)本置于二甲苯、無水乙醇、95%、85%、75%乙醇中脫蠟，接著將標(biāo)本置于檸檬酸鹽抗原修復(fù)盒中修復(fù)。10%山羊血清室溫下封閉30 min。一抗（AR、GFAP及VIM單克隆抗體，稀釋度1：200）溶液，4℃過夜孵育，第2天于二抗溶液室溫下孵育1 h，DAB顯色后沖洗。蘇木精復(fù)染，1%鹽酸分化，氨水反藍(lán)。梯度酒精中脫水，二甲苯中透明，中性樹脂封片，并于顯微鏡下觀察。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.2.3數(shù)據(jù)采集 數(shù)據(jù)來源癌癥和腫瘤基因圖譜（Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）中腦膠質(zhì)瘤病理資料及蛋白表達(dá)譜數(shù)據(jù)（時間截止為2016年12月31日），通過R軟件（https：//www.r-project.org/）對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。由2名研究人員對原始數(shù)據(jù)及整理好的數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立審核，當(dāng)結(jié)論出現(xiàn)不一致時，由2名研究者共同討論決定。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進(jìn)行Log-rank檢驗，Pearson相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 AR、GFAP、VIM在腦惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況

AR、GFAP及VIM在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小均無關(guān)（P>0.05）；隨著腦膠質(zhì)瘤病理級別的升高，AR、GFAP、VIM表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2 AR、GFAP、VIM在腦惡性膠質(zhì)瘤與正常腦組織中的表達(dá)情況

為進(jìn)一步明確AR、GFAP、VIM在腦惡性膠質(zhì)瘤與正常腦組織中的表達(dá)情況，通過免疫組化檢測GFAP、AR、VIM蛋白表達(dá)，結(jié)果提示，GFAP、AR、VIM在腦惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)均顯著高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

2.3 AR、GFAP、VIM對腦惡性膠質(zhì)瘤總生存期的影響

由于本研究樣本量小，隨訪時間短，故選取TCGA數(shù)據(jù)庫中162例腦惡性膠質(zhì)瘤患者的臨床數(shù)據(jù)分析AR、GFAP、VIM表達(dá)對總生存期（OS）的影響。依據(jù)表達(dá)水平不同，將其分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖（圖2），并進(jìn)行Log-rank檢驗，結(jié)果提示，兩組的AR、VIM表達(dá)水平均顯著影響腦惡性膠質(zhì)瘤患者的OS（P<0.05），而兩組的GFAP表達(dá)水平對患者的OS無影響（P>0.05）（表2、圖2）。

2.4 GFAP、AR、VIM在腦惡性膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示，AR表達(dá)與VIM表達(dá)成中等正相關(guān)（r=0.641，P=0.000），AR表達(dá)與GFAP表達(dá)成中等正相關(guān)（r=0.533，P=0.000），GFAP表達(dá)與VIM表達(dá)無明顯相關(guān)性（r=-0.007，P>0.05）。

3討論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜、脈絡(luò)叢上皮、神經(jīng)元等部位，其中多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度最高[3]。臨床治療以手術(shù)切除為主，輔以放化療治療，雖然治療手段不斷改進(jìn)，但總死亡率居高不下。探究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及治療方法仍是研究的重難點(diǎn)。本研究通過檢測腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及分析TCGA數(shù)據(jù)庫中腦膠質(zhì)瘤的AR、GFAP及VIM表達(dá)及臨床病理特征相關(guān)性，為腦膠質(zhì)瘤患者的分子診斷、預(yù)后標(biāo)記物提供理論及實踐依據(jù)。

AR是類固醇激素受體大家族的一員，是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，配體存在時，AR與熱休克蛋白解離釋放配體結(jié)合域，二聚化后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮增殖、侵襲作用[4]。研究表明，AR信號通路在乳腺癌、前列腺癌、肝癌及膀胱癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-6]。AR通過調(diào)控β1-整合素-AKT信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附，抑制遷移；AR可活化基因ID1促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲；AR可介導(dǎo)STAT3和AKT信號通路活化腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤，并抑制其凋亡[7-8]。GFAP是一種相對分子質(zhì)量為50×103～52×103的酸性蛋白，對神經(jīng)元起支撐和營養(yǎng)作用，是星形膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞源性腫瘤的標(biāo)志蛋白[9]。研究表明，腦膠質(zhì)瘤患者生存期與GFAP水平成正相關(guān)，提示GFAP水平不僅可以作為腦膠質(zhì)瘤腫瘤分級的判斷標(biāo)準(zhǔn)，還可以用于判斷患者的預(yù)后情況[10]。也有研究者表明，腦膠質(zhì)瘤的惡性程度與GFAP表達(dá)成顯著負(fù)相關(guān)，分化越差，GFAP表達(dá)越少甚至完全不表達(dá)，指出GFAP可以作為該類腫瘤惡性程度及預(yù)后判定的一項良好標(biāo)志物[11]。GFAP與臨床預(yù)后差異的存在可能是由于研究樣本大小、隨訪時間、陽性截斷值不同。VIM屬于中間纖維的波形纖維蛋白類，與增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，是目前較為確定間質(zhì)標(biāo)志物之一，也是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要分子基礎(chǔ)[12-14]。包陸君等[15]指出，VIM在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常腦組織，同時VIM亦參與調(diào)控腫瘤瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移，為臨床上膠質(zhì)瘤分級診斷及預(yù)后狀況等方面提供了有價值的指標(biāo)。

選取我院就診的腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果提示，AR、GFAP及VIM在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)顯著高于正常腦組織（P<0.05），三者表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小均無明顯相關(guān)（P>0.05），但在高級別腫瘤中表達(dá)顯著高于低級別腫瘤，提示AR、GFAP及VIM與病理分期、分級有關(guān)。目前AR、GFAP及VIM在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)意義均有研究報道，但三者相關(guān)性研究罕有報道。通過分析TCGA中腦膠質(zhì)瘤中三者蛋白表達(dá)，結(jié)果提示，AR表達(dá)與VIM表達(dá)成中等正相關(guān)（r=0.641，P=0.000），AR表達(dá)與GFAP表達(dá)成中等正相關(guān)（r=0.533，P=0.000），GFAP表達(dá)與VIM表達(dá)無明顯相關(guān)（r=-0.007，P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析亦得出AR與VIM高表達(dá)顯著降低腦膠質(zhì)瘤患者總生存期，是腦膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后指標(biāo)，而在本研究中GFAP與總生存期無明顯相關(guān)，與前人研究存在差異，需進(jìn)一步分析探究。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤組織中AR、GFAP及VIM均呈高表達(dá)，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，臨床上可通過對上述三項指標(biāo)表達(dá)情況進(jìn)行檢測，明確其具體機(jī)制并加以干預(yù)，為腦膠質(zhì)瘤患者的診斷、治療以及預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2018-08-20 本文編輯：任秀蘭）