穆璐　　郁峰

[摘要] 目的 檢測α-SMA（α-Smooth muscle actin）、ROCK-2（Rhoass ociated coiled-coil forming protein kinase-2）在缺氧缺血新生大鼠腦組織的表達，探討Rho（Rho guanosinetriphosphatases）/ROCK信號通路的激活在新生大鼠缺氧缺血再灌注腦損傷中的意義。 方法 將SD大鼠的7 d齡新生鼠（n=48）隨機分為兩組：真手術(shù)組包括3個不同時段的缺氧缺血性腦病后2 h、6 h、24 h組和相對時段的假手術(shù)對照組，采用多克隆抗體免疫組織化學(xué)SP法觀察α-SMA、ROCK-2的表達。 結(jié)果 假手術(shù)組在各時段α-SMA、ROCK-2表達無明顯變化；HIBD組中α-SMA，ROCK-2在不同時間點呈上升趨勢；ROCK-2與α-SMA的表達呈正相關(guān)。 結(jié)論 ROCK-2與α-SMA在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后隨著時間表達呈上升趨勢，證明ROCK-2與α-SMA參與HIBD的病理生理過程，從而說明RHO/ROCK信號通路的激活參與了新生鼠缺氧缺血性腦病的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 新生鼠；腦組織；缺氧缺血；ROCK-2；α-SMA

[中圖分類號] R345.4 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）31-0033-04

Relationship between ROCK-2， α-SMA and ROCK Signaling in neonatal rats after hypoxic-ischemic reperfusion injury

MU Lu YU Feng

Department of Pediatrics， Huzhou Central Hospital in Zhejiang Province， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To detect the expression of α-SMA（α-Smooth muscle actin） and ROCK-2（Rhoass ociated coiled-coil forming protein kinase-2） in the brain tissue of neonatal rats with hypoxia-ischemia， and to explore the significance of activation of the Rho（Rho guanosinetriphosphatases）/ROCK signaling pathway in hypoxic-ischemic reperfusion injury in neonatal rats. Methods 7-day-old neonatal rats（n=48） from SD rats were randomLy divided into two groups： the real surgery group consisted of 2， 6， and 24 hours after hypoxic ischemic encephalopathy and the sham-operated control group. The expression of α-SMA and ROCK-2 was observed by polyclonal antibody immunohistochemical SP method. Results There was no significant change in the expression of α-SMA and ROCK-2 in the sham operation group. The α-SMA and ROCK-2 in the HIBD group showed an increasing trend at different time points. ROCK-2 was positively correlated with the expression of α-SMA. Conclusion ROCK-2 and α-SMA increase with time after hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats， which proves that ROCK-2 and α-SMA participate in the pathophysiological process of HIBD， thus indicating the activation of RHO/ROCK signal pathway is involved in the development of hypoxic ischemic encephalopathy in neonatal rats.

[Key words] Newborn rats； Brain tissue； Hypoxia-ischemia； ROCK-2； α-SMA

新生兒缺氧缺血性腦?。╪eonatal hypoxic-ischemic encephalopat，NHIE）是因圍生期窒息所導(dǎo)致的新生兒腦缺氧缺血損害，臨床表現(xiàn)包括精神發(fā)育遲滯、癲癇、腦癱及智力低下等。Rho/ROCK（Rhoass ociated coiled-coil forming protein kinase，Rho）是體內(nèi)普遍存在的一條信號通路，它通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的聚合從而扮演著“分子開關(guān)”的角色[1]，參與細胞形態(tài)、粘附、遷移、增殖、凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、平滑肌收縮等過程，影響細胞的極性、移動、粘附、形態(tài)改變、生長、凋亡[2]。ROCK是其重要的酶，分為ROCK-1和ROCK-2，ROCK-1主要在心臟、肺臟、骨骼肌、腎臟和胰臟等組織表達；ROCK-2主要在腦中表達[3]。目前發(fā)現(xiàn)ROCK的下游靶分子約有二十余種[4]，包括α-SMA、MMP、MLCP等。本課題通過新生7 d大鼠缺氧缺血腦損傷模型的建立，比較與假手術(shù)組腦組織內(nèi)Rho/ROCK相關(guān)信號分子在不同時間點的表達差異，探討該通路的激活與NHIE腦損傷的病理生理過程中的相關(guān)性。從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑探討NHIE發(fā)病機制，為NHIE防治提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新生7 d SD大鼠48只（揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心），雌雄不拘，平均體重12～15 g；抗兔ROCK單克隆抗體，抗鼠α-SMA單克隆抗體，羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG（Santa公司）；ABC法免疫組化試劑盒（博士德公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

切片機：Leica RM2135 德國；顯微鏡：日本尼康（Nikon）TE2000-U；純水儀：HEAL FORCE NW 10UF 香港；移液器：Thermo Finnpipette 美國；微波爐：Galanz P7021TP-6中國；切片漂烘儀：科力飛QP-B安徽合肥電子研究所；恒溫箱：上海福馬GHX-9270B-1中國；干燥箱：上海精宏DHG-9140A中國；攪拌器：國華88-1中國；自動脫水機：亞光ZT-12M湖北孝感；石蠟包埋機：亞光YB-7B湖北孝感；氧濃度監(jiān)測儀：上海美西智能電子儀器有限公司；超低溫冰箱：青島海爾特種電器有限公司；液氮罐：上海奧然科貿(mào)有限公司；超凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 新生7 d SD大鼠48只，隨機分為兩組。手術(shù)組24只：HIBD后2 h，6 h，24 h時間點各8只；假手術(shù)組24只：3個對應(yīng)時點的假手術(shù)組各8只。

1.3.2 動物實驗 參照RICE法[5]，手術(shù)組結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，術(shù)后回復(fù)30 min放入缺氧箱（氧飽和度8%～10%）2 h后，回到正常環(huán)境分別2 h、6 h、24 h取腦組織（海馬、皮質(zhì)）。假手術(shù)組僅游離右頸總動脈，不結(jié)扎不缺氧。

1.3.3 取材 新生大鼠乙醚麻醉，開胸后經(jīng)左心室灌注固定液[（9 g/L生理鹽水100 mL，40 g/L多聚甲醛，0.1 mol/L PBS（磷酸緩沖鹽溶液）100 mL]，至肝臟變白及肺水腫后開顱取鼠腦組織（海馬、皮質(zhì)等）于固定液中固定8 h，予梯度酒精脫水、石蠟包埋，行冠狀切片（4 μm）。

1.3.4 免疫組化實驗 參照蔡文琴[6]方法。ROCK-2的檢測，一抗為抗兔ROCK單克隆抗體（1：200，PBS稀釋），ABC法后續(xù)染色；二抗為羊抗兔IgG，DAB顯色；假手術(shù)對照組以PBS代替第一抗體其余同前。α-SMA的檢測，一抗為抗鼠α-SMA單克隆抗體（1：200，PBS稀釋），ABC法后續(xù)染色；二抗為羊抗鼠IgG，DAB顯色；假手術(shù)對照組以PBS代替第一抗體，其余同前。

1.3.5 圖像分析 應(yīng)用Image-Pro.Plus4.0彩色病理圖像分析，光學(xué)顯微鏡（400倍）觀察，海馬和皮質(zhì)切片10個視野，在同一光強度下，細胞漿、胞膜染成棕黃色為陽性細胞，以單個標(biāo)本為單位，選擇平均光密度值為參數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

處理采用SPSS 19.0完成。計量資料以（x±s）表示，兩獨立樣本比較采用兩樣本t檢驗，各組間比較采用單因素方差分析（one-way ANVOA），多樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK檢驗，兩因素間相關(guān)性分析采用直線相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生大鼠腦組織ROCK-2免疫組化表達

ROCK-2在新生鼠大腦皮質(zhì)及海馬處可見黃褐色的細胞陽性表達，主要分布于神經(jīng)元胞體和整個軸突部分。HIBD后6 h、24 h組ROCK-2的陽性表達較假手術(shù)組明顯增多。見封三圖1（放大400倍）。表1表明HIBD后2 h、6 h、24 h組ROCK-2表達平均光密度值較對應(yīng)假手術(shù)組有顯著性差異（P<0.05），HIBD后2 h組與6 h、24 h組間比較也有顯著性差異（P<0.05），HIBD后6 h組與24 h組間比較無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 新生大鼠腦組織α-SMA免疫組化表達

見表2。α-SMA在腦組織大腦皮層及海馬處均可見黃褐色的細胞陽性表達，主要分布于神經(jīng)元胞體和整個軸突。HIBD后6 h、24 h組α-SMA的陽性表達較假手術(shù)組增多。新生大鼠腦組織α-SMA免疫組化表達圖像見封三圖2（放大400倍）。

2.3 ROCK-2與α-SMA的相關(guān)性分析

3 討論

最近研究表明，Rho蛋白作為在信號調(diào)節(jié)中的一個關(guān)鍵分子，能夠調(diào)節(jié)多個受體來控制多個細胞進程，比如細胞骨架重構(gòu)、細胞粘附、細胞增殖、細胞運動、細胞周期調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[7]。Rho是Ras超家族中的一個亞群，由約200～300個氨基酸組成信號多肽[8]。RhoGTP酶在細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為信號轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān)，它有與GDP結(jié)合或GTP結(jié)合的兩種失活或激活狀態(tài)，前者定位在細胞漿內(nèi)，而后者與細胞膜相結(jié)合。目前發(fā)現(xiàn)ROCK的下游靶分子約有二十余種[4]，包括MLCP、α-SMA、MMP等。深入了解Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有助于闡明其與HIE發(fā)病發(fā)展的關(guān)系，為HIE的治療與預(yù)后提供新的方法。

從本實驗發(fā)現(xiàn)新生鼠HIBD后2 h、6 h、24 h組腦組織中ROCK-2的陽性表達較假手術(shù)組增多，且隨著時間增加，陽性細胞呈上升趨勢；且HIBD 2 h組與6 h、24 h組間比較也有顯著性差異。表明在HIBD的病理生理過程中ROCK-2的表達增多且有時間依賴性的上升趨勢。Rho發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移、聚集、突起的生長及抑制中樞神經(jīng)再生等功能，均通過激活ROCK而實現(xiàn)[9，10]。Hamid等[11]通過實驗動物缺血再灌注損傷模型，在缺血35 min和再灌注10 min后兩個時間點測定ROCK活性，結(jié)果表明，缺血組ROCK活性沒有變化，再灌注組ROCK活性增加1.7倍，從而推斷ROCK活性增加主要發(fā)生在缺血后再灌注期間。

Rho蛋白作為一個關(guān)鍵的“分子開關(guān)”，通過一個復(fù)雜的磷酸化與去磷酸化的信號級聯(lián)放大過程促使肌絲蛋白和肌動蛋白（α-SMA）互動，促進肌動蛋白微絲骨架的聚合，從而使細胞收縮[12]。通過引起細胞纖維狀肌動蛋白細胞骨架改變，導(dǎo)致細胞之間的間隙增大、內(nèi)皮通透性增高，致血漿蛋白滲出，引起組織器官水腫功能障礙。本實驗顯示說明α-SMA在新生鼠HIBD后6 h，24 h組中α-SMA的陽性表達較假手術(shù)組增多。HIBD 2 h組與6 h，24 h組間比較無顯著性差異（P>0.05）。由此推測α-SMA作為Rho/ROCK信號通路最后的效應(yīng)分子，當(dāng)激活后與肌球蛋白交聯(lián)促進肌動蛋白微絲骨架的聚合，從而參與了HIBD的病理生理過程。

ROCK接受Rho傳遞的活化信號，發(fā)生磷酸化而激活，并介導(dǎo)其下游一系列底物如肌球蛋白磷酸酶、肌球蛋白輕鏈等磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)，使得α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）與肌球蛋白交聯(lián)增加，促進肌動蛋白微絲骨架的聚合[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，在肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)的調(diào)控中小G蛋白Rho/ROCK信號通路有重要的作用[14]。細胞膜肌動蛋白骨架結(jié)構(gòu)的變化是調(diào)節(jié)細胞通透性的重要機制，許多炎癥介質(zhì)和細胞因子，如內(nèi)皮素-1、血管緊張素II、白介素-1、腫瘤壞死因子（TNF）和凝血酶等均能激活RhoP/Rho激酶，使MLC磷酸化及整合素聚集，導(dǎo)致細胞膜收縮，通透性增加，屏障功能受損。有研究證明LPA作為Rho激動劑，可誘發(fā)神經(jīng)鞘細胞α-SMA改變[14]。孫驊等[15]觀察到：ROCK-1基因和蛋白隨腎間質(zhì)纖維化程度的加重而逐漸升高；其表達較肌成纖維細胞標(biāo)志的a-SMAm RNA提前到達高峰，兩者呈顯著正相關(guān)。因此本實驗通過測得各個時間點ROCK-2與α-SMA各自的表達量，說明ROCK-2與α-SMA的表達呈正相關(guān)，與研究結(jié)果一致。ROCK-2的活化及啟動α-SMA對于HIBD中Rho/ROCK信號通路的激活是不可缺少的。

近年來隨著不斷的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)細胞的再生和修復(fù)是可能的，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性（central nervous system plasticity）理論：神經(jīng)在環(huán)境因素變化或受損時，具有結(jié)構(gòu)和功能相應(yīng)變化和修復(fù)的能力。David和Aguayo報道，在外周神經(jīng)移植中，損傷的中樞神經(jīng)軸突可以再生長，并提示在中樞神經(jīng)內(nèi)環(huán)境中存在抑制神經(jīng)再生長的物質(zhì)[10，16]。這些抑制因子分別為髓鞘相關(guān)糖蛋白、勿動蛋白、少突膠質(zhì)細胞髓鞘糖蛋白等。這些抑制因子將信號傳入細胞內(nèi)，導(dǎo)致Rho/ROCK的活化[17]。ROCK可通過肌球蛋白輕鏈的磷酸激酶失活的方式，使磷酸化的MLC水平上調(diào)，刺激肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合，活化的肌動蛋白的解聚因子cofilin可以切斷肌絲，使肌動蛋白鏈解聚，從而抑制軸突外生[14]。

本實驗結(jié)果顯示α-SMA、ROCK-2的表達水平不同時段有上升趨勢，并顯著高于對照組，而且兩者具有顯著的相關(guān)性，說明ROCK-2與α-SMA參與HIBD的病理生理過程及Rho/ROCK信號通路激活參與缺氧缺血新生大鼠的腦損傷過程。抑制RhoA和ROCK均可提高損傷后CNS的軸突再生和功能恢復(fù)。Rho/Rho激酶信號通路為治療細胞屏障功能損傷提供了靶位點。抑制Rho/ROCK途徑的法舒地爾已應(yīng)用于臨床，法舒地爾是目前已知的唯一能應(yīng)用于臨床治療的Rho信號通路抑制劑[18]，它通過抑制細胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈磷酸化的水平而抑制細胞骨架功能。另外Rho激酶抑制劑可明顯增加冠心病患者的運動耐量并減輕心絞痛的發(fā)作程度[19-21]，能對抗由于肝、腎移植后缺血再灌注損傷[22]。由此推測Rho/ROCK途徑可能成為一個新的治療血管疾病的治療途徑。通過對中樞神經(jīng)再生的抑制分子和Rho信號通路的分析，為以后的研究及其相關(guān)臨床治療提供更多新的方法。

[參考文獻]

[1] Hahn A，Heusinger RIBEIRO J，Lanz T，et al.Induction of connective tissue growth factor by activation of heptahelical receptors.Modulation by Rho proteins and the actin cytoskeleton[J].J Biol Chem，2000，275（48）：37429-37435.

[2] Wettschureck N，Offermanns S.Rho/Rho-kinase mediated signaling in physiology and pathophysiology[J].J Mol Med，2002，80（10）：629.

[3] Ark M，Yilmaz N，Yazici G，et al.Rho-associated protein kinase Ⅱ（rock Ⅱ） expression in normal and preeclamptic human placentas[J].Placenta，2005，26：81-84.

[4] Gervaise L，Patrice G，Pierre P.Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology[J].Circ Res，2006，98（3）：322.

[5] Rice JE，Vannucci RC，Brierky JB.The innuence of immatu rity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J].Ann Neuro1，1981，9（2）：131-141.

[6] 蔡文琴.現(xiàn)代實用細胞與分子生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2003：104.

[7] Wettschureck N，OffemLanns S.Rho/Rho kinase mediated signaling in physiology and pathophysiology[J].J Mol Med，2002，80（10）：629.

[8] Liedberg F，Anderson H，Chebil G，et al.Tissue microarray based analysis of prognostic markers in invasive bladder cancer：Much effort to no avail[J]. Urol Oneol， 2008，26（1）：17-20.

[9] Raftopoulou M，Hall A.Cell migration：Rho GTPaseslead the way[J].Dev Biol，2004，265：23.

[10] Yiu G，He ZG.Signaling mechanisms of the myelin inhibitors of axon regeneration[J].Curr Opin Neurobiol，2003， 13：545.

[11] Hamid SA，Bower HS，Baxter GF.Rho kinase activation plays a major role as a mediator of irreversible injury in reperfused myocardium[J].Am J Physiol Heart Cire Physiol，2007，292 （6）：H259-H260.

[12] Nusrat A，Giry M，Turner JR，et al.Rhoprotein regulates tight junctions and perijunc tional actin organization in polarized epithelia[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995， 92：10629-10633.

[13] Erik Sahai，Marshall CJ.Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis[J].Nature Cell Biology，2003，5：711-719.

[14] Barber SC，Mellor H，Gampel A，et al.S1 Pand LPA trigger Schwann cell actin changes and migration[J].Eur J Neurosci，2004，19：3142-3l50.

[15] 孫驊，陳榮華，黃文彥，等.ROCK-I激酶在腎間質(zhì)纖維化大鼠不同階段腎組織中的激活及意義[J].中華腎臟病雜志，2004，20（4）：127-131.

[16] Tang BL.Inhibitors of neuronal regeneration：Mediators and signaling mechanisms[J].Neurochem Int，2003，42：189.

[17] Schwab ME.Nogo and axon regeneration[J].Curr Opin Neurobiol，2004，14：118.

[18] Mimura F，Yamagishi S，Arimura N，et a1.Myelin—associated glycoprotein inhibits microtubule assembly by a Rho kinase-dependent mechanism[J].J Biol Chem，2006， 281（23）：159-170.

[19] Mohri M，Shimokawa H，Hirakawa Y，et al.Rho-kinaseinhibition with intracoronary fasudil prevents myocardial ischemia in patientswith coronary microvascular spasm[J].J Am Coll Cardiol，2003，41（1）：15-19.

[20] Shimokawa H，Hiramori K，Iinuma H，et al.Anti-anginal effect offasudil，a Rho-kinase inhibitor，in patients with stable effort angina：Amulticenter study[J].J Cardiovasc Pharmacol，2002，40（5）：751-761.

[21] Vicari RM，Chaitman B，Keefe D，et al.Efficacy and safety of fasudil in patients with stable angina：a double-blind，placebo-controlled，phase 2 trial[J].J Am Coll Cardiol，2005，46（10）：1803-1811.

[22] Versteilen AM，Korstjens U，Musters RJ，et al.Role of cyclooxygenase and derived reactive oxygen species in rho-kinase-mediated impairment of endothelium-de-pendent vasodilation and blood flow after ischemia-reperfusion of the rat kidney[J].Nephron Exp Nephrol，2009，114（1）：e1-e6.

（收稿日期：2018-05-30）