王思偉，王學(xué)清，石少輕，李元迎，王 昆*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北 石家莊 050000；2.河北一獸藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050000）

奶牛的泌乳行為由神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)分泌的多種激素和乳腺分泌的多種生長(zhǎng)因子協(xié)同調(diào)控[1]，其中，以生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH） 為核心的生長(zhǎng)激素軸對(duì)奶牛泌乳起重要的調(diào)控作用[2]。但是，GH作為生物大分子，無法直接穿透細(xì)胞膜，故需要與位于靶細(xì)胞膜上的生長(zhǎng)激素受體（growth hormone receptor，GHR）結(jié)合，經(jīng)由介導(dǎo)體傳遞信息至細(xì)胞內(nèi)，才能發(fā)揮其功能。因此，GHR在奶牛機(jī)體組織中的含量和功能，以及GHR基因堿基序列的突變都可能影響GH的生理效應(yīng)，從而影響奶牛的產(chǎn)奶性狀[3]。

牛的GHR基因位于第20號(hào)染色體[4]，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。Georges等[4]和Arranz等[5]在奶牛第20號(hào)染色體上檢測(cè)到了影響奶牛泌乳性狀的QTL。Blott等[6]首次發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛GHR基因的cDNA序列第836位存在T→A的單核苷酸突變，導(dǎo)致第279位氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)槔野彼幔‵279Y）。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，該突變位點(diǎn)可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量顯著增加，乳脂率和乳蛋白率顯著下降。這一結(jié)論在芬蘭艾爾奶牛群體中也得到了驗(yàn)證[7]。因此，奶牛GHR基因的F279Y突變位點(diǎn)被認(rèn)為是影響奶牛泌乳性狀的重要候選基因之一。

候選基因與數(shù)量性狀的連鎖關(guān)系通常出現(xiàn)在某一群體或特定群體的特定世代中，并與該群體的特定遺傳背景相互作用。因此，為了將候選基因的遺傳效應(yīng)應(yīng)用于畜禽經(jīng)濟(jì)性狀的標(biāo)記輔助選擇中，就需要在不同品種或同一品種的不同群體中不斷進(jìn)行驗(yàn)證，甚至在同一群體中也要經(jīng)過多個(gè)世代的驗(yàn)證[8]。河北是我國(guó)重要的奶牛養(yǎng)殖區(qū)域，2016年全省奶牛存欄約180.6萬頭，奶類總產(chǎn)量達(dá)448.0萬t，居全國(guó)第3位。探討河北地區(qū)荷斯坦奶牛GHR基因的遺傳多態(tài)性及其與主要泌乳性狀的遺傳效應(yīng)，以期為奶牛分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為859頭中國(guó)荷斯坦奶牛血樣，分別采自河北省石家莊鹿泉、石家莊藁城、石家莊正定、唐山蘆臺(tái)和保定的5個(gè)牛場(chǎng)，產(chǎn)奶性狀的表型記錄由河北省畜牧良種工作站DHI中心提供。每頭牛采集血液5 mL，即刻放入抗凝離心管中，上下?lián)u動(dòng)，編號(hào)并用冰盒保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行奶牛基因組DNA提取，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取。

1.2.2 引物合成與PCR擴(kuò)增 根據(jù)牛GHR基因核酸序列（NM 176608），利用primer premier 6.0引物設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為5’-AATACTTGGGCTAGCAGTGACAATAT-3’，下游引物序列為 5’-ACTGGGTTGATGAAACACTTCACTC-3’。PCR產(chǎn)物的預(yù)期長(zhǎng)度為175 bp。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中，MasterMix 10.0 μL，上游引物 0.6 μL，下游引物 0.6 μL，基因組DNA模板1.0 μL，超純水7.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸7 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 RFLP分析 RFLP反應(yīng)體系為10 μL，其中，PCR產(chǎn)物7.5 μL，限制性核酸內(nèi)切酶SSpⅠ（10 U/μL）0.5 μL，Buffer 2.0 μL。反應(yīng)條件為 37 ℃ 30 min。酶切產(chǎn)物上樣于2.5%瓊脂糖凝膠，恒壓160 V，電泳50～60 min，在紫外燈下觀察拍照，記錄結(jié)果。

1.2.4 測(cè)序分析 經(jīng)PCR-RFLP分析后，每個(gè)基因型隨機(jī)回收純化2個(gè)個(gè)體的PCR產(chǎn)物，送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行正反方向直接測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1 基因型頻率和等位基因頻率 根據(jù)公式計(jì)算得到。

基因型頻率=基因型個(gè)體數(shù)/測(cè)定群體總數(shù)

等位基因A的頻率〔p（A）〕：

p（A）=D＋1/2H

等位基因 T的頻率 〔q（T）〕：

q（T） =R＋1/2H

式中，D、H、R分別為AA、TA和TT基因型頻率。

遺傳雜合度（He）：

有效等位基因數(shù)（Ne）：

式中，pi為群體中第i個(gè)等位基因的頻率，n為等位基因數(shù)。

多態(tài)信息含量（PIC）：

式中，pi和pj分別為群體中第i和第j個(gè)等位基因的頻率，m為等位基因數(shù)。

皮爾遜卡方檢驗(yàn)：

式中，O代表群體中每個(gè)基因型的觀測(cè)數(shù)目，E代表假定Hardy-Weinberg平衡定律成立時(shí)每個(gè)基因型的期望個(gè)體數(shù)。

1.3.2 基因型與泌乳性能相關(guān)性分析 采用SAS（8.02）軟件的MIXED過程進(jìn)行產(chǎn)奶性狀和基因型的關(guān)聯(lián)分析。動(dòng)物模型為：

式中，y為產(chǎn)奶性狀表型記錄，μ為群體平均值，F(xiàn)為場(chǎng)次效應(yīng)，T為胎次效應(yīng)，G為基因型效應(yīng)，a為加性遺傳效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

1.3.3 等位基因加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和替代效應(yīng) 根據(jù)公式計(jì)算得到。

等位基因加性效應(yīng)：

等位基因顯性效應(yīng)：

等位基因替代效應(yīng)：

式中，p為A等位基因頻率，q為T等位基因頻率，TT、AA和TA分別為各基因型的表型最小二乘均值。

等位基因替代效應(yīng)的顯著性檢驗(yàn)利用線性回歸模型（SAS），計(jì)算泌乳性狀對(duì)T等位基因拷貝數(shù)（0、1、2） 的回歸，分別將基因型TT、TA和AA定義為2、1和 0。

2 結(jié)果與分析

2.1 GHR基因F279Y位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分析

以中國(guó)荷斯坦?；蚪MDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增GHR基因F279Y位點(diǎn)，獲得了1條長(zhǎng)度175bp的片段。采用限制性內(nèi)切酶SSpⅠ消化后，PCRRFLP的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示3種基因型：175 bp，175、151、24 bp，151、24 bp，分別命名為TT、TA和AA。其中，長(zhǎng)度24 bp的片段未顯示。

圖1 GHR基因F279Y位點(diǎn)的PCR-RFLP擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR-RFLP amplification results of GHR gene F279Y locus

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，基因型TT、TA和AA的頻率分別為0.394 6、0.544 8和0.060 5；等位基因T和A的頻率分別為 0.667 1和 0.332 9。PIC為 0.33（0.25＜PIC＜0.50），屬中度多態(tài)。He為0.444 2，Ne為1.799 2，Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，該位點(diǎn)在河北荷斯坦奶牛群體中極顯著偏離平衡狀態(tài)。

2.2 GHR基因F279Y位點(diǎn)擴(kuò)增片段的測(cè)序

圖2 GHR基因F279Y位點(diǎn)不同基因型的測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of different genotypes of F279Y locus of GHR gene

將測(cè)序結(jié)果（圖2） 與用GenBank中DGAT1基因的序列（GenBank登錄號(hào)：NM 176608） 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與TT基因型的核苷酸序列一致，AA基因型在第4 962 bp位點(diǎn)發(fā)生了T/A單堿基突變。

2.3 GHR基因F279Y位點(diǎn)與泌乳性狀的遺傳效應(yīng)

GHR基因F279Y變異位點(diǎn)對(duì)中國(guó)荷斯坦奶牛5個(gè)泌乳性狀的遺傳分析結(jié)果（表1）顯示，該突變位點(diǎn)對(duì)乳脂率的影響達(dá)到了顯著水平，而對(duì)乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量和305 d產(chǎn)奶量的影響不顯著。多重比較結(jié)果表明，TT基因型的乳脂率顯著高于AA基因型，AA和TA、TT和TA基因型之間的差異不顯著。TA基因型的乳脂量、乳蛋白量和305 d產(chǎn)奶量均高于其他2個(gè)純合基因型，但未達(dá)到顯著水平。等位基因替代效應(yīng)顯示，每個(gè)A等位基因替代T等位基因會(huì)導(dǎo)致乳脂率降低0.053%，乳脂量降低0.332 kg，乳蛋白率提高0.003%，乳蛋白量提高1.43 kg，305 d產(chǎn)奶量降低59.481 kg。T等位基因是乳脂率的優(yōu)勢(shì)等位基因。

表1 GHR基因F279Y位點(diǎn)基因型與泌乳性狀的遺傳效應(yīng)分析Table 1 The genetic effects of F279Y locus genotypes of GHR gene on the milk production traits

3 結(jié)論與討論

GHR基因是影響奶牛泌乳性狀的重要候選基因之一，明確該基因的遺傳多態(tài)性及其對(duì)奶牛泌乳性狀的影響，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，對(duì)提高奶牛產(chǎn)奶性狀，加快育種進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)品種改良具有深遠(yuǎn)意義。Banos等[9]對(duì)571頭蘇格蘭荷斯坦奶牛該位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，等位基因A的頻率為0.20，T的頻率為0.80，TT型為優(yōu)勢(shì)基因型，與Sirja等[7]對(duì)芬蘭愛爾夏牛的研究結(jié)果一致。王麗娟等[10]對(duì)天津和濟(jì)南的351頭荷斯坦奶牛進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)等位基因A和T的基因頻率分別為0.633 9和0.366 1，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，與馬彥男等[1]對(duì)甘肅232頭奶牛的檢測(cè)結(jié)果一致。而馬妍等[11]對(duì)北京地區(qū)1 145頭荷斯坦奶牛進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，等位基因A和T的基因頻率分別為0.361和0.639，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門，與郭曉飛等[12]和楊雪瑤等[13]的研究結(jié)果一致。本研究對(duì)河北地區(qū)859頭荷斯坦奶牛的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，等位基因A和T的頻率分別為0.332 9和0.667 1，T為優(yōu)勢(shì)等位基因，與馬妍等[11]、郭曉飛等[12]和楊雪瑤等[13]的研究結(jié)果一致。經(jīng)計(jì)算，該位點(diǎn)處于中度多態(tài)，遺傳改良潛力較好，等位基因分布較均勻，極度偏離H-W平衡，說明該位點(diǎn)在河北地區(qū)受到了非自然選擇。綜合分析表明，該位點(diǎn)在河北荷斯坦奶牛群體中處于被非自然選擇因素破壞了平衡狀態(tài)，是適合應(yīng)用于遺傳選育的候選位點(diǎn)。

研究證實(shí)，GHR基因突變位點(diǎn)F279Y對(duì)奶牛的泌乳性狀有顯著影響，但不同研究結(jié)果顯示的影響指標(biāo)略有不同。Banos等[9]研究表明，等位基因A能提高奶牛的產(chǎn)奶量。Sirja等[7]對(duì)芬蘭愛爾夏牛的研究結(jié)果顯示，等位基因A是產(chǎn)奶量的優(yōu)勢(shì)等位基因，T是乳脂率和乳蛋白率的優(yōu)勢(shì)等位基因。馬彥男等[1]研究表明，AA基因型的305 d產(chǎn)奶量顯著高于AT基因型，AT基因型的乳脂量、乳蛋白量和乳糖量雖然高于AA基因型，但未達(dá)到顯著水平；楊雪瑤等[13]則認(rèn)為，3種基因型之間的305 d產(chǎn)奶量差異不顯著，TT基因型的乳蛋白率和乳脂率極顯著高于其他2個(gè)基因型；王麗娟等[10]的研究結(jié)果顯示，TT基因型的乳脂率顯著高于AA型，其他指標(biāo)未達(dá)到顯著水平。本研究發(fā)現(xiàn)，該突變位點(diǎn)對(duì)奶牛的乳脂率有顯著影響，等位基因T是乳脂率的優(yōu)勢(shì)等位基因，與王麗娟等[10]的研究結(jié)果一致；同時(shí)，TA基因型與純合基因型相比具有更高的乳脂量、乳蛋白量和305 d產(chǎn)奶量，但未達(dá)到顯著水平，與馬彥男等[1]的研究結(jié)果相似。

綜上所述，GHR基因F279Y突變位點(diǎn)對(duì)河北地區(qū)荷斯坦奶牛的乳脂率遺傳效應(yīng)較大，可將其應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇。GHR基因的F279Y位點(diǎn)對(duì)奶牛的產(chǎn)奶性能具有重要的調(diào)控作用。但是，由于環(huán)境條件、品種以及選育背景等因素影響，GHR基因的F279Y位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性對(duì)不同地區(qū)不同群體奶牛泌乳性狀的影響不盡相同。因此，要想將該基因?qū)嶋H應(yīng)用于奶牛品種選育，還需明確該基因?qū)ρ芯咳后w的具體遺傳效應(yīng)，并結(jié)合其他候選基因進(jìn)行綜合分析。