劉衛(wèi)花，趙光峰

(海南省中醫(yī)院，海南 ?？?570100)

帕金森病(PD)的病理基礎為黑質中的多巴胺能神經(jīng)元(DN)發(fā)生病變，導致多巴胺(DA)的生成發(fā)生障礙，從而造成神經(jīng)元內多巴胺能與膽堿能兩系統(tǒng)間平衡失調，進而表現(xiàn)出靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)異常等臨床表現(xiàn)[1-2]。其中，miRNA 作為一類非編碼小RNA分子，參與調控細胞凋亡、自噬，在介導PD的發(fā)生及發(fā)展中占據(jù)重要地位[3-4]。

1 自噬與PD

1.1自噬的生物學特點 自噬是指細胞在受到內外環(huán)境的不利因素(如營養(yǎng)缺乏、低氧等)刺激時的一種自我保護的過程。該過程將細胞內變性的蛋白質和受損、衰老的細胞器，甚至病原微生物通過溶酶體降解，以實現(xiàn)物質的再循環(huán)和維持細胞代謝平衡及內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬(CMA)等[5]。自噬是細胞生存的一種方式，同時也是死亡使者，對細胞死亡的調節(jié)具有雙重性。溫和的自噬一定程度上保護細胞免受有害條件的侵害而促進細胞存活；當胞內待降解物質的積累速率超過自噬的清除能力，就會引起自噬嚴重或快速過度的激活，直接導致細胞程序性死亡，被稱為自噬性細胞死亡(ACD)[6]。

1.2自噬參與PD PD主要病理改變是中腦黑質區(qū)致密部多巴胺能神經(jīng)元的缺失和路易小體的沉積，具體機制被認為與氧化應激，線粒體功能障礙和蛋白質清除功能障礙，α-突觸核蛋白的錯誤折疊、聚集和異常降解等相關[7]。線粒體功能障礙可以表現(xiàn)為線粒體外膜滲透，導致神經(jīng)元凋亡；蛋白質清除功能障礙是因為細胞自噬功能紊亂，亦會引起神經(jīng)元自噬性死亡；α-突觸核蛋白的突變會破壞α-螺旋結構，使其結構以形成β-折疊，進一步聚集，產(chǎn)生神經(jīng)毒性寡聚體的動作，引起細胞內的α-突觸核蛋白聚集，抑制自噬，引起惡性循環(huán)，導致神經(jīng)退行性改變。同時，突變型的α-突觸核蛋白可以與溶酶體膜上的受體結合，并影響其降解和其他物質相結合[8]。Hu等[9]從在體和離體角度，分別應用MPP+和MPTP誘導的細胞和動物PD模型用于研究地骨皮甲素對PD的影響。離體研究結果表明地骨皮甲素可以改善細胞損傷和線粒體膜電位(MMP)的損傷，并抑制MPP+誘導的神經(jīng)元細胞Bax/Bcl-2比例和調控MAPKs家族。此外，動物實驗表明，地骨皮甲素可改善運動功能和神經(jīng)元活性，并增加黑質(SN)和紋狀體(Str)中酪氨酸羥化酶(TH)的陽性細胞；降低腦中α-突觸核蛋白的表達。地骨皮甲素在體外和體內都發(fā)揮了明顯的自噬增強作用?？傮w來說，由于凋亡抑制和自噬增強而保護免受神經(jīng)毒素誘導的PD，這表明自噬在PD發(fā)病中的重要性不容忽視。

自噬溶酶體途徑(ALP)是初級溶酶體與來自自噬作用的含有內源性物質的囊泡即自噬體融合或溶酶體吞噬細胞質而形成，在細胞內起“清道夫”作用，是破壞細胞器和清除細胞內受損蛋白質的重要手段。 ALP損傷被認為與PD的發(fā)病機制相關，晚近研究發(fā)現(xiàn)一些衍生自天然植物的活性化合物可能通過調節(jié)ALP并在PD的實驗模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用，初步證實，提高神經(jīng)元自噬效用可能是PD治療中的有效策略[10]。Xu等[11]報道了一種來源于萸肉果實的化合物loganin在PD的小鼠模型中介導神經(jīng)保護作用的效用。通過以30 mg/(kg·d)的劑量給予1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)5 d，建立亞急性PD模型并用loganin處理。結果顯示，Loganin能降低紋狀體中多巴胺水平和酪氨酸羥化酶(TH)表達，縮短小鼠的總運動活性(TLA)時間。此外，loganin緩解小膠質細胞和星形膠質細胞的活化，并通過c-Abl-p38-NFκB途徑抑制TNF-α和caspase-3的表達，下調LC3-II和Drp1表達，降低酸性囊泡細胞器(AVOs)的水平。證實Loganin通過減少炎癥、自噬和細胞凋亡對MPTP誘導的PD小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用，鑒于神經(jīng)元自噬和凋亡在PD發(fā)病中的重要性，有效調控神經(jīng)元自噬、凋亡對于PD防治是有效的。

研究發(fā)現(xiàn)，微管依賴性轉運、線粒體功能障礙和自噬性病理學的變化參與了散發(fā)性PD的神經(jīng)變性。然而，連接這些事件的機制鏈接仍然不明。在散發(fā)性PD患者來源的細胞中，NAD+代謝發(fā)生改變，導致Sirtuin-2的活化和隨后的乙?；?α-微管蛋白水平的降低。Sirtuin-2脫乙酰酶活性的抑制選擇性地增強α-微管蛋白乙?；?，促進了錯誤折疊的蛋白質的運輸和清除。而且，Sirtuin-2敲除小鼠神經(jīng)元在暴露于1-甲基-4-苯基吡啶鎓離子(MPP+)后微管組裝沒有改變，允許維持正常的自噬通量。說明sirtuin-2可能通過乙?；刂谱允上到y(tǒng)功能，證實自噬介導散發(fā)性PD中線粒體代謝與神經(jīng)變性之間的關系[12]。

顯然，自噬參與PD的多個環(huán)節(jié),調節(jié)PD中神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)元自噬的途徑將會是一個非常有效的神經(jīng)保護措施。

2 miRNA與PD

2.1miRNA的生物學特點 miRNA是有21～23個核苷酸(nt)的非編碼單鏈微小RNA，能夠通過序列特異性的方式來調節(jié)靶基因表達。miR是由一段具有發(fā)夾環(huán)結構，長度為70～80 nt 的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)Dicer酶加工后生成的。成熟miRNA與RNA誘導的基因沉默復合物(RISC)結合形成非對稱RISC復合物。RISC復合物中的單鏈miRNA與靶mRNA上任意與之互補的序列配對，從而抑制基因轉錄或使mRNA降解而抑制基因表達[13]。miRNA 是動植物生長發(fā)育過程中重要的調節(jié)因子，參與胚胎發(fā)育、細胞分化、器官發(fā)生、物質代謝等廣泛的生命過程。對尸檢證實的PD和正常對照病例的SNCA 3'非翻譯區(qū)進行了深度測序分析，然后對鑒定潛在的微小RNA(miRNA)結合位點，進行遺傳關聯(lián)分析。研究確定4個miRNA結合位點，并觀察到不同同基因誘導的多能干細胞衍生的多巴胺能和膽堿能神經(jīng)元中每個miRNA的神經(jīng)元型特異性表達譜。通過miRNA調節(jié)SNCA表達是神經(jīng)元型特異性的，可能在α-突觸核蛋白表型異質性中起作用，參與PD的發(fā)病[14]。

2.2miRNA在PD中的作用 晚近報道，miR-137、miR-124和miR-184在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，對神經(jīng)元調節(jié)至關重要[15]。研究表明，microRNA與PD密切相關，miR-7、miR-153、miR-34b和miR-34 c在PD中表達均顯著下降，并直接調控α-突觸核蛋白突變[16]。國內學者觀察miR-137對Parkin誘導的線粒體自噬影響，將miR-137 mimics和miR-137 inhibitor分別轉染進HeLa細胞8 h后，再轉染pEGEPC1-Parkin，24 h之后加羰基-氰-對-三氟甲氧基本腙(FCCP)處理4 h或者不加FCCP，利用免疫熒光和蛋白免疫印跡技術分析miR-137對線粒體自噬的影響[17]。用實時定量PCR方法檢測PD患者與健康對照者血液樣本中miRNAs的表達情況。miR-137能通過抑制線粒體自噬受體FUNDC1和NIX的表達，調節(jié)低氧誘導的線粒體自噬miR-137在PD患者血液中的表達顯著高于對照組，據(jù)此推測，miR-137能抑制Parkin誘導的線粒體自噬，miR-137表達高，則Parkin誘導的線粒體自噬水平低，而細胞內低水平的自噬恰好是PD的誘因之一。研究發(fā)現(xiàn)，致病性LRRK2的miRNA活性抑制功能被神經(jīng)元細胞命運決定簇TRIM32直接拮抗。說明miRNA活性抑制可能是防治PD的重要靶標[18]。

亦有學者發(fā)現(xiàn)，miR-124是一個高度表達于神經(jīng)系統(tǒng)內的miRNA，其表達含量比其他組織的100倍還要豐富，在例如腦脊髓炎和膠質瘤疾病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表達下降，同時對于缺血性腦損傷和卒中等疾病具有顯著的神經(jīng)保護作用。王慧清[19]發(fā)現(xiàn)在MPTP帕金森病小鼠中腦組織和黑質區(qū)多巴胺能神經(jīng)元內miR-124表達下降，另外MPP+刺激的SH-SY5Y細胞中miR-124表達也下降，提示miR-124可能為帕金森病早期診斷的一個生物標志物。利用側腦室置管給藥的方法，發(fā)現(xiàn)外源性給以miR-124激動劑后，MPTP帕金森病小鼠黑質區(qū)多巴胺能神經(jīng)元缺失減少，中腦組織內的多巴胺水平下降減少，提示miR-124對帕金森病具有神經(jīng)保護作用。Kanagaraj等[20]收集109例PD患者和40例年齡和性別匹配的健康志愿者(對照組)血清樣品。提取包裹在血清中的外來體樣微囊中的RNA，并逆轉錄。通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)分析血清miRNA，建立ROC曲線分析miRNA準確鑒別PD的能力。并進一步驗證了miR-19b的下調和miR-195和miR-24在PD患者中的上調。與對照組比較，miR-19b、miR-24和miR-195的曲線下面積(AUC)值分別為0.753,0.908和0.697。因此，血清中miR-19b、miR-24和miR-195的表達水平可能對PD的診斷有益。

Wang等[21]從表觀遺傳學角度，研究微小RNA在患者和對照組的扣帶回的表達。來自患者和對照組的744個具有良好表征的miRNAs在回旋曲線中的表達譜TaqMan陣列miRNA芯片。通過SYBR Green qRT-PCR驗證顯著失調的miRNAs。通過TaqMan陣列的第一個篩選鑒定了在患者的扣帶回中上調的43個微小RNA。在這些microRNAs中，13個被預測調節(jié)以單基因形式的PD(DJ-1，PARK2，PINK1，LRRK2，SNCA和HTRA2)突變的6個基因中的至少一個。還發(fā)現(xiàn)這13種微RNA(miR-144，miR-199b，miR-221，miR-488, miR-544)中的5種被SYBR Green qRT-PCR上調，并被預測調節(jié)SNCA、PARK2、LRRK2或其組合?；颊咧蠸NCA、PARK2和LRRK2的表達減少。另外5個測試的潛在目標基因中有5個被下調。這些是由miR-199b、線粒體甲硫氨酸(MTFMT)的miR-221、鋅指蛋白440(ZNF440)調控的由miR-144、Ellis Van Creveld蛋白(EVC)調節(jié)的DNA損傷調節(jié)的自噬調節(jié)劑1(DRAM) tRNA甲酰轉移酶，由miR-544可能控制的miR-488和XIRP2(Xin肌動蛋白結合重復含有)。該研究確定了可能通過修飾SNCA、PARK2、LRRK2表達和其他方法在PD病因中發(fā)揮作用的五種微小RNA正常細胞功能所需的基因。

Liu等[22]應用人SK-N-SH神經(jīng)母細胞瘤細胞與不同濃度的MPP+一起培養(yǎng)，誘導PD模型，然后分析miR-181a的表達。繼而用miR-181a過表達、沉默后，觀察自噬蛋白標記物(LC3II、LC3I和Beclin 1)和p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/c-Jun N-末端激酶(JNK)信號轉導檢測蛋白(p-p38、p38、p-JNK和JNK)以及細胞凋亡。隨著MPP+濃度的升高，miR-181a的表達逐漸降低。與MPP++ miR-181a干擾組相比，miR-181a的過表達顯著降低了LC3II/LC3I比例，Beclin1表達，細胞凋亡和p-p38和p-JNK的表達。這表明miR-181a通過抑制p38 MAPK/JNK途徑調節(jié)PD中的凋亡和自噬。

顯然，miRNA可能是早期診斷PD的一種敏感生物標志物，并且調控miRNA的表達有望延緩PD的疾病進展。

3 展 望

近年來，關于miRNA和自噬在神經(jīng)退行性病變中的發(fā)病機制研究日益增多,可以肯定miRNA誘導細胞自噬、神經(jīng)元凋亡是防治PD的有效靶點，但是關于miRNA具體通過什么信號途徑，如何有效調控神經(jīng)元自噬的問題目前都尚無定論，有待于深入分析和鑒定，亦有望為PD防治提供新的靶點。