孫浩行，汪 驊，王長(zhǎng)城 綜述，李保國(guó) 審校

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海迪申生物技術(shù)有限公司研發(fā)部，上海 201201；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025)

以低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高為特點(diǎn)的血脂異常是引起動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的重要危險(xiǎn)因素[1]。目前，國(guó)際專家組和科學(xué)指南均聲明LDL-C為ASCVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并將減少ASCVD發(fā)病率及病死率的治療方針專注于降低LDL-C上[2]。然而，部分研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)ASCVD患者進(jìn)行降脂治療后，ASCVD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)卻只減少了不到30%，部分患者LDL-C水平雖已降低至正常范圍仍會(huì)發(fā)生ASCVD[1-2]?？梢?jiàn)，單從LDL-C定量評(píng)估ASCVD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和病情嚴(yán)重存在局限性。近來(lái)，低密度脂蛋白(LDL)亞組分顆粒大小的變化引起了人們關(guān)注。LDL為多分子復(fù)合物，在物理特性上具有異質(zhì)性，可分為一系列密度、體積和動(dòng)力學(xué)行為各不同的亞組分，密度為1.006～1.063 g/mL[3]。LDL異質(zhì)性會(huì)導(dǎo)致各亞組分膽固醇水平不同，如LDL亞型顆粒直徑減少3 nm，膽固醇減少約40%[4]。研究表明，LDL亞組分與ASCVD密切相關(guān)，同LDL-C相比，LDL亞組分能更好地評(píng)估ASCVD的發(fā)生和發(fā)展[2,5]。因此，ASCVD的臨床血脂檢測(cè)研究應(yīng)注重LDL亞組分的檢測(cè)分析。本文就LDL亞組分的分型及其與ASCVD的關(guān)系和最新分離檢測(cè)方法等方面予以綜述。

1 LDL亞組分

1.1LDL亞組分的分型 LDL亞組分主要是依據(jù)顆粒直徑和密度進(jìn)行分型。AUSTIN等[6]用梯度凝膠電泳根據(jù)顆粒直徑不同將LDL分為兩類：直徑≥25.5 nm的大而輕LDL(lbLDL)和直徑<25.5 nm的小而密LDL(sdLDL)。GEISS等[7]用密度梯度超速離心法(DGUC)根據(jù)密度不同將LDL分為7種亞型：LDL-1和LDL-2為lbLDL；LDL-3和LDL-4為中間密度LDL(ILDL)；LDL-5、LDL-6和LDL-7為sdLDL 。若進(jìn)一步用DGUC分離sdLDL，可得到密度為1.044～1.060 g/mL的極小密度低密度脂蛋白(V-sdLDL)。同樣，有研究者采用3%預(yù)制聚丙烯酰胺管狀凝膠電泳(TGE)分離出7種LDL亞組分[8]。另外，有研究者用離子淌度法(IM)得到4種LDL亞型：LDL-Ⅰ、LDL-Ⅱ、LDL-Ⅲ和LDL-Ⅳ[9]；在此基礎(chǔ)上，KRAUSS等[10]用IM法進(jìn)一步得到7種LDL亞組分：LDL-Ⅰ為lbLDL；LDL-Ⅱa和LDL-Ⅱb為ILDL；LDL-Ⅲa和LDL-Ⅲb為sdLDL；LDL-Ⅳa和LDL-Ⅳb為V-sdLDL。LDL亞組分的分型方法有很多，雖然由于方法學(xué)原理不同而導(dǎo)致各研究結(jié)果有所差異，但總體的分型一致。迄今，國(guó)際上并未有標(biāo)準(zhǔn)的LDL亞組分分型標(biāo)準(zhǔn)，以上幾種暫為目前研究領(lǐng)域常見(jiàn)分型。

1.2LDL亞組分與ASCVD 近年來(lái)，有研究表明，LDL亞組分不僅與ASCVD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，并且比LDL-C能更好地評(píng)估ASCVD及相關(guān)疾病[10]。SHIFFMAN等[11]采用TGE法研究416例患者的LDL亞組分與心血管疾病(CVD)的關(guān)系，得出LDL-1和HDL均與CVD呈負(fù)相關(guān)，而LDL-3和LDL-6則與CVD呈正相關(guān)，并指出LDL亞組分顆粒間的變化是解釋LDL-C不能準(zhǔn)確評(píng)估CVD的可能因素。此后，SRISAWASDI等[12]又研究了260例患者的LDL亞組分與代謝綜合征(MetS)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，LDL-C與MetS無(wú)顯著相關(guān)性，而回歸分析得到比值(LDL-3～LDL-6)/LDL-1與MetS有顯著相關(guān)性(P<0.001)，表明(LDL-3～LDL-6)/LDL-1可作為評(píng)估MetS患者血脂代謝狀態(tài)的優(yōu)秀指標(biāo)。

sdLDL作為L(zhǎng)DL亞組分中密度大和體積較小的顆粒，由于其易于穿過(guò)動(dòng)脈血管內(nèi)壁，與LDL受體結(jié)合能力低，不易清除；在血漿中具有較長(zhǎng)的半衰期、糖化易感性高、抗氧化性較低等特點(diǎn)，具有更強(qiáng)的致ASCVD潛在能力。諸多研究表明，sdLDL比LDL-C具有更重要的檢測(cè)意義。MELANDER等[5]用IM法分析了1 919例使用他汀類藥物未受益型CVD患者的LDL亞組分發(fā)現(xiàn)，隨著患者sdLDL增加，CVD發(fā)病率提高了2.3倍。與此類似的是，SHIFFMAN等[11]從馬爾默預(yù)防計(jì)劃參與者中隨機(jī)抽取1 784例CVD患者作為研究對(duì)象，在控制年齡、性別、高血壓、抽煙和糖尿病等傳統(tǒng)因素的影響后，發(fā)現(xiàn)LDL各亞組分都與CVD相關(guān)(P<0.001)；進(jìn)一步控制LDL-C、HDL-C和TG因素后，sdLDL仍與CVD相關(guān)(P=0.03)。另外，MOGAREKAR等[13]在探究絕經(jīng)后女性更易出現(xiàn)ASCVD原因時(shí)發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性體內(nèi)sdLDL水平明顯增高，sdLDL與年齡、三酰甘油、總膽固醇和LDL-C等呈正相關(guān)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)，指出定量檢測(cè)sdLDL比單純檢測(cè)LDL-C更具臨床價(jià)值。

2 LDL亞組分分離檢測(cè)方法

2.1DGUC DGUC是根據(jù)LDL顆粒浮力密度的不同，經(jīng)不同密度梯度鹽溶液超速離心后LDL各亞組分依次轉(zhuǎn)移至各密度區(qū)域。研究者可根據(jù)實(shí)際需求調(diào)整密度梯度，得到分型不同的亞組分。連續(xù)的DGUC可同時(shí)將脂蛋白各組分及亞組分分離，是分離LDL亞型的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”方法，但所需血清樣品較多，分離時(shí)間長(zhǎng)，耗資高。并且由于脂蛋白a[Lp(a)]密度和sdLDL密度存在交叉區(qū)，分離LDL亞組分易受Lp(a)的影響。DONG等[14]選擇1.044 g/mL作為lbLDL與sdLDL的分界點(diǎn)密度，在密度大于1.044 g/mL的分離溶液中加入巰基乙醇成功消除了Lp(a)的影響，得到兩種LDL亞型：lbLDL(1.006～1.044 g/mL)和sdLDL(1.044～1.063 g/mL)。另外，由垂直轉(zhuǎn)頭發(fā)展的VAP-Ⅱ密度梯度超速離心法能同時(shí)分離和定量檢測(cè)LDL亞組分。VAP-Ⅱ法是利用垂直轉(zhuǎn)頭密度梯度超速離心LDL后，經(jīng)VAP-Ⅱ在線膽固醇檢測(cè)儀檢測(cè)后繪制出LDL亞組分的分布曲線，然后根據(jù)各曲線積分面積比例計(jì)算亞組分水平。同傳統(tǒng)超速離心相比，VAP-Ⅱ法將離心時(shí)間縮短至1 h，并擁有高分辨率的特點(diǎn)。WILLIAMS等[15]采用VAP-Ⅱ法得到4種LDL亞組分，發(fā)現(xiàn)LDL亞組分中sdLDL與CVD相關(guān)性最強(qiáng)，并且獨(dú)立于傳統(tǒng)血脂指標(biāo)。

2.2梯度凝膠電泳法(GGE) GGE是采用從大到小梯度孔隙的凝膠對(duì)LDL亞組分進(jìn)行分離，并根據(jù)所占總?cè)旧娣e的比例計(jì)算出各組分水平。AUSTIN等[6]用2%～16%的非變性聚丙烯酰胺梯度凝膠將LDL分為A型和B型，而WILLIAMS等[15]用2%～14%的非變性聚丙烯酰胺梯度凝膠得到7種LDL亞組分。此外，Berkeley HeartlabTM分段梯度凝膠電泳系統(tǒng)(LDL-S3GGETM)也可將LDL分離為7種亞組分。LDL-S3GGETM是分離LDL亞組分已標(biāo)準(zhǔn)化的梯度凝膠電泳體系，適用于臨床診斷，但僅局限在Berkeley Heartlab實(shí)驗(yàn)室。GGE為一般實(shí)驗(yàn)室研究LDL亞組分常用方法，但分離時(shí)間在12 h之上。

2.3TGE Quantimetrix公司研發(fā)的LipoprintTM脂蛋白分析系統(tǒng)采用3%高分辨率線性TGE可將LDL分為7種亞組分。其原理是：血清與上樣膠溶液(含親脂染料蘇丹黑B，可與脂蛋白中的膽固醇酯結(jié)合)混合加于濃縮膠上，經(jīng)30 min光聚合后，每管3 mA，電泳60 min，避光靜止30 min后在610 nm下進(jìn)行光密度掃描?；诜肿雍Y效應(yīng)各亞型LDL分布在VLDL與HDL間，然后根據(jù)阻滯系數(shù)Rf值(RfVLDL=0，RfHDL=1)對(duì)LDL分型：Rf>0.40，sdLDL；Rf為0.38～0.40，ILDL；Rf<0.38，lbLDL。其中Rf值等于LDL亞組分與VLDL間距離/VLDL與HDL間距離的比值。LipoprintTM系統(tǒng)通過(guò)了美國(guó)FDA認(rèn)證，可用于LDL臨床診斷，具有良好的應(yīng)用前景。BANULS等[16]將LipoprintTM系統(tǒng)的TGE法同GGE法對(duì)比分析LDL亞組分發(fā)現(xiàn)，兩種方法在檢測(cè)lbLDL(145例)和sdLDL(32例)時(shí)一致性分別達(dá)到97.2%和81.3%。還有學(xué)者在LipoprintTM系統(tǒng)的基礎(chǔ)上做了優(yōu)化，PATHAK等[17]根據(jù)質(zhì)量設(shè)計(jì)方法發(fā)明一種分析LDL亞組分的高通量非變性TGE，采用3.15%分離膠可同時(shí)對(duì)40個(gè)樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，t檢測(cè)結(jié)果同LipoprintTM系統(tǒng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.05)，同時(shí)將每個(gè)樣品檢測(cè)的成本降低到2美元。

2.4毛細(xì)管電泳法(CE) 毛細(xì)管等速電泳(CITP)可以將分離后的LDL組分壓縮成窄小區(qū)帶，具有高分辨率的特點(diǎn)。MORENO-GORDALIZA等[18]發(fā)明一種分離LDL亞組分的新型CITP法，在pH為8.8～9.4的梯度下9.5 min內(nèi)完成分析，得到6個(gè)LDL亞組分峰。此外，由傳統(tǒng)CE發(fā)展來(lái)的微芯片電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在刻蝕有微泳道的小型基片上分離檢測(cè)LDL亞組分。WANG等[3]在此系統(tǒng)上向樣品液中添加直徑5 nm、80 nmol/L的納米金提高了LDL亞組分間的分辨率。

2.5核磁共振法(NMR) NMR是根據(jù)LDL顆粒內(nèi)核和外殼中脂類甲基團(tuán)的質(zhì)子磁共振信號(hào)檢測(cè)顆粒大小，利用甲基團(tuán)信號(hào)不同區(qū)分各亞組分，以NMR甲基團(tuán)振幅測(cè)定亞組分濃度。MATYUS等[19]采用了NMR法對(duì)LDL進(jìn)行檢測(cè)分析，得到3種亞組分，批內(nèi)、批間的精確度和重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)CV為2.6%～5.8%，結(jié)果符合臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)，可用于個(gè)人臨床診斷。NMR雖能快速全自動(dòng)檢測(cè)LDL亞組分，但由于儀器特殊，難以在一般實(shí)驗(yàn)室展開(kāi)。

2.6IM IM原理是使用電噴射產(chǎn)生氣溶膠單電荷大粒子，然后經(jīng)過(guò)不同的流動(dòng)分析單元在大氣壓下根據(jù)離子淌度不同產(chǎn)生分離，隨后冷凝聚集各粒子，最后進(jìn)行激光散射掃描檢測(cè)，將LDL顆粒直徑和數(shù)量轉(zhuǎn)化為各自的峰值和濃度。KRAUSS等[10]用IM分析了經(jīng)兩種血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑——默沙東和阿托伐他汀治療后患者體內(nèi)的LDL亞組分，結(jié)果顯示雖然二者明顯減少了患者LDL組分?jǐn)?shù)量，但阿托伐他汀不會(huì)降低LDL-Ⅳb水平，且默沙東會(huì)使患者LDL-Ⅳ水平增加，推測(cè)V-sdLDL可能是患者經(jīng)降脂治療后仍出現(xiàn)ASCVD的關(guān)鍵因素。IM可直接對(duì)LDL亞組分顆粒大小和水平進(jìn)行定量檢測(cè)，是近年用于分離檢測(cè)LDL亞組分的新方法，并且IM與DGUC、NMR和GGE等方法都具有良好的一致性[17]。

2.7其他檢測(cè)方法 除了以上方法，較常見(jiàn)的LDL亞組分檢測(cè)方法還有均相檢測(cè)法、動(dòng)態(tài)光散射法和高效液相色譜法等。動(dòng)態(tài)光散射法用兩種乳膠粒子溶液作為標(biāo)準(zhǔn)，以散射光的波動(dòng)強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)LDL亞組分，需要較高的專業(yè)技術(shù)，設(shè)備也昂貴。高效液相色譜法檢測(cè)LDL亞組分，需要對(duì)樣品進(jìn)行超速離心預(yù)處理，檢測(cè)費(fèi)時(shí)。DONG等[14]將HPLC和DGUC結(jié)合建立了一種新型同時(shí)檢測(cè)HDL和LDL亞組分的方法，準(zhǔn)確度和靈敏度達(dá)到了臨床診斷的水平。近來(lái)有報(bào)道，用陰離子交換色譜法可將LDL分為5種亞組分：L1～L5，電負(fù)性依次升高，并推測(cè)與已氧化LDL顆粒類似的L5為主要的LDL，是致ASCVD的主要LDL亞組分[20]。

3 小 結(jié)

國(guó)內(nèi)外對(duì)于ASCVD的防治指南都將降低LDL-C放在首位。然而在臨床治療中，LDL-C雖已降低，但ASCVD仍有發(fā)生。單純檢測(cè)LDL-C水平并不能全面評(píng)估ASCVD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)轉(zhuǎn)移至LDL的微觀結(jié)構(gòu)上。大量研究都已證實(shí)，LDL亞型組分和ASCVD有直接的相關(guān)性，特別是sdLDL對(duì)ASCVD的危險(xiǎn)評(píng)估優(yōu)于其他常規(guī)血脂指標(biāo)，這使LDL亞組分的分離檢測(cè)尤為重要。雖然已報(bào)道的LDL分析方法有很多，但能用于臨床自動(dòng)化分析的很少。加快研究LDL亞組分分離檢測(cè)新方法，使其盡快走向臨床自動(dòng)化分析尤為重要。而且，目前國(guó)際上并未有劃分LDL亞組分的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各分離檢測(cè)方法間也沒(méi)用統(tǒng)一的評(píng)價(jià)規(guī)則，導(dǎo)致采用各方法學(xué)研究LDL亞組分的結(jié)論有所差異。這在一定程度上阻礙了LDL檢測(cè)分析和LDL亞組分與ASCVD關(guān)系的研究。因此，未來(lái)需提高LDL亞組分的分離檢測(cè)方法，并制訂評(píng)價(jià)各方法的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，盡快走向臨床自動(dòng)化分析。另外，探究LDL亞組分與ASCVD發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制也將會(huì)推動(dòng)LDL亞組分的分離檢測(cè)和ASCVD的防控與治療。