方志紅， 崔苗苗， 張 燕， 任彬琳， 石永紅， 劉建寧，王運(yùn)琦，董寬虎， 高洪文， 吳欣明*

(1. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 山西 太原 030032； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所， 北京 100193；3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 山西 太谷 030801)

鹽脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要因素之一[1]，全世界約有8億公頃的土地被鹽化，其中約有五分之一的可耕地受到鹽脅迫的危害[2-3]，土壤中的Na+是影響植物生長(zhǎng)的主要因子，高濃度的Na+會(huì)對(duì)植物體造成生理性干旱和離子毒害[4]，從而抑制植物的生長(zhǎng)甚至?xí)鹬参锼劳鯷5-6]，為了生存，植物會(huì)利用各種各樣的機(jī)制來(lái)抵御環(huán)境中的有害因子[7-8]。SOS(salt overly sensitive)信號(hào)通路是植物抵御鹽脅迫的一個(gè)至關(guān)重要的途徑，它主要揭示了在鹽脅迫下植物體內(nèi)關(guān)于離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和耐鈉性的機(jī)理[9]，SOS1、SOS2和SOS3在一條共同的SOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用，通過(guò)對(duì)該通路中SOS1、SOS2和SOS3突變體的研究發(fā)現(xiàn)，SOS1(Salt Overly Sensitive 1)是植物在抵御鹽脅迫的過(guò)程中必需的一個(gè)重要的、與植物耐鹽性關(guān)系最直接的一個(gè)基因[4]，它編碼的SOS1蛋白可以將植物體內(nèi)的多余的Na+進(jìn)行區(qū)隔化或外排來(lái)降低細(xì)胞中的Na+濃度來(lái)適應(yīng)高濃度的鹽環(huán)境[3,10-12]，從而降低鹽脅迫的傷害[13-15]。

已經(jīng)有很多研究表明，SOS1基因在植物的耐鹽方面起著重要作用，它主要在介導(dǎo)Na+外排、參與Na+的長(zhǎng)距離運(yùn)輸、介導(dǎo)K+的吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)pH幾個(gè)方面起著重要的作用[16-18]。近些年來(lái)，質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS1)在植物耐鹽性研究中的作用受到廣泛重視，SOS1基因最初是在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)的，擬南芥SOS1突變體對(duì)鹽超敏感，對(duì)其進(jìn)行過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn)可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，表明它在植物的耐鹽機(jī)制中起著非常重要的作用[19-20]。其后許多植物的SOS1基因已經(jīng)被克隆鑒定和進(jìn)行了功能分析，如十字花科植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)[21]、鹽芥(Thellungiellasalsuginea)[22]、芥菜(Brassicajuncea)[23]，楊柳科植物胡楊(Populuseuphratica)[24]，藜科植物鹽地堿蓬(Suaedasalsa)[25]，番杏科植物海馬齒(Sesuviumportulacastrum)[26]，蒺藜科植物霸王(Zygophyllumxanthoxylum)[27]，禾本科植物小麥(Triticumaestivum)[28]、水稻(Oryzasativa)[29]、大麥(Hordeumvulgare)[30]、獐茅(Aeluropuslittoralis)[31]，茄科植物番茄(Lycopersiconesculentum)[32]，豆科植物大豆(GlycinemaxandGlycinesoja)[33]和草木樨(Melilotusofficinalis)[34]。這些研究都可以表明，在鹽脅迫下SOS1蛋白可以通過(guò)減少根部Na+的累積來(lái)提高植物的耐鹽性。很多實(shí)驗(yàn)研究也都可以表明SOS1基因可以恢復(fù)并使其轉(zhuǎn)化體的耐鹽能力增強(qiáng)[26,28,33,35-41]。

雖然SOS1基因在很多植物中被克隆鑒定，但是在豆科植物中研究的比較少，只是在大豆和草木樨中被報(bào)道，紫花苜蓿SOS1基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。紫花苜蓿易于栽培、產(chǎn)量高，是可以為家畜提供優(yōu)良蛋白飼料的重要豆科牧草[42-43]，但是在鹽堿地上不能大面積的種植[44]，為了解決這一問(wèn)題，利用生物技術(shù)手段培育抗逆性強(qiáng)的品種則成為一條切實(shí)可行的有效途徑[45]，本研究利用同源克隆的方法獲得了紫花苜蓿MsSOS1基因的全長(zhǎng)cDNA序列并對(duì)其進(jìn)行了分析和不同逆境脅迫下的表達(dá)分析，以期為探討SOS1基因所在的SOS途徑在紫花苜蓿中的作用機(jī)制和合理開(kāi)發(fā)利用紫花苜蓿培育抗逆新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以紫花苜蓿(Medicagosativa)種子(中苜1號(hào)，北京畜牧獸醫(yī)研究所提供)為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)所需的試劑為ExTaq(Takara)、DNA Maker(Takara)、pMD?18-Tvector(Takara)，Total RNA(Invitrogen)，RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)，大腸桿菌菌株E.coliDH5α(北京天根生化科技有限公司)，凝膠DNA回收試劑盒(Axygen)，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，In-Fusion?HD Cloning Kit(Clontech)，其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1材料培養(yǎng)與處理 挑選籽粒飽滿且整齊度一致的紫花苜蓿種子，消毒后用滅菌蒸餾水沖洗2～3遍，播種于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出兩片子葉后，移至1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)箱溫度為(28±2)℃/(23±2)℃，光照時(shí)間16 h·d-1，光照強(qiáng)度約600 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度60%～80%。培養(yǎng)4周后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的紫花苜蓿幼苗進(jìn)行脅迫處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。干旱和ABA處理分別用25% PEG6000和100 μmmol·L-1ABA處理0，12，24，48，72 h，冷脅迫(4℃)處理0，4，8，12，24 h后，取其葉片；組織表達(dá)特異性分析是分別采取同一株紫花苜蓿上的根、莖、葉和花等組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 參照Trizol總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)(Invitrogen公司)提取1.2.1中樣品的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量后進(jìn)行cDNA的合成(cDNA Synthesis Kit,Fermentas公司)，產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI上查找到的其它物種的SOS1基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，排除相似性不高的序列，找到高度保守的區(qū)域，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物MsSOS1-F和MsSOS1-R(表1)，送英俊公司合成。

1.2.4紫花苜蓿MsSOS1基因保守區(qū)片段的克隆 PCR擴(kuò)增體系為(10 μl體系)：10×Ex Taq Buffer 1 μl，dNTP Mixture 1 μl，cDNA(<500 ng) 0.5 μl，TaKaRa Ex Taq(5 U/μl)0.1 μl，引物MsSOS1-F(10 μm)1 μl，MsSOS1-R(10 μm)1μl，ddH2O 5.4 μl。擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 60 s，30 cycles；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接到載體pMD?18-T上，轉(zhuǎn)化DH5α后挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.5紫花苜蓿MsSOS1基因全長(zhǎng)克隆 根據(jù)克隆得到的紫花苜蓿MsSOS1基因中間片段設(shè)計(jì)3′-RACE引物MsSOS1-F1和5′-RACE引物MsSOS1-F2(表1)，進(jìn)行全長(zhǎng)PCR的擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物連接載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并挑取陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)中的引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.6紫花苜蓿MsSOS1基因的生物信息學(xué)分析 利用軟件DNAStar進(jìn)行紫花苜蓿MsSOS1基因ORF的查找和氨基酸翻譯；利用ExPASy工具對(duì)MsSOS1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的預(yù)測(cè)分析、信號(hào)肽預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行分析；利用DNAMAN6.0進(jìn)行序列的同源性比對(duì)分析，MEGA 5.10軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(NJ法)。

1.2.8Real-time PCR檢測(cè)紫花苜蓿MsSOS1基因的組織表達(dá)特異性 根據(jù)紫花苜蓿MsSOS1基因的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)Real-time PCR引物qRT-MsSOS1-F、qRT-MsSOS1-R(表1)，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參設(shè)計(jì)特異性引物Actin-F、Actin-R(表1)。使用Bio-Rad CFX96進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 2min，94℃ 5sec，58℃ 15sec，72℃ 10sec，45個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

利用2-△△Ct方法[46]中的△△Ct=(CtTarget-CtActin)處理-(CtTarget-CtActin)對(duì)照公式計(jì)算紫花苜蓿根、莖、葉、花中MsSOS1基因的表達(dá)量并繪出柱形圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿MsSOS1基因中間片段的獲得

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模版，PCR擴(kuò)增得到約784 bp的目的片段(如圖1所示)，將PCR結(jié)果進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示獲得的目的片段序列與鷹嘴豆(Cicerarietinum)、大豆(Glycinemax)、花生(Arachisipaensis)、綠豆(Vignaradiata)等基因的同源性達(dá)到80%以上，據(jù)此推斷該序列是紫花苜蓿MsSOS1基因的一部分，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 紫花苜蓿MsSOS1基因5′端序列和3′端序列的獲得

根據(jù)獲得的目的片段設(shè)計(jì)RACE引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了5′端片段序列(約1 785 bp)和3′端片段序列(約2 712 bp)(如圖1所示)，利用軟件將獲得的5′端序列、3′端序列和中間序列進(jìn)行拼接，最終獲得紫花苜蓿MsSOS1基因的全長(zhǎng)cDNA序列(約3 757 bp)。設(shè)計(jì)ORF(開(kāi)放閱讀框)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約3 000 bp的特異性目的條帶，測(cè)序后確定該序列為紫花苜蓿MsSOS1基因ORF序列(約2 580 bp)。

2.3 紫花苜蓿MsSOS1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1紫花苜蓿MsSOS1基因全長(zhǎng)序列及蛋白的理化性質(zhì)分析 紫花苜蓿MsSOS1基因全長(zhǎng)cDNA序列長(zhǎng)3 757 bp，包含922 bp的5′非編碼區(qū)，2 580 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)和255 bp的3′非編碼區(qū)(圖2)，編碼一個(gè)分子式為C4337H6816N1156O1258S31、相對(duì)分子量為96.3 kDa、理論等電點(diǎn)為6.51的氨基酸序列(859 aa)(表3)。含有堿性氨基酸(K,R)88個(gè)；酸性氨基酸(D,E)94個(gè)；疏水氨基酸(A,I,L,F,W,V)320個(gè)；極性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)218個(gè)。該蛋白中Leu(97個(gè),11.3%)，Ser(86個(gè),10.0%)，Val(59個(gè),6.9%)，Glu(58個(gè),6.8%)和Ala(58個(gè),6.8%)相對(duì)含量比較多；Asp+Glu為94，Arg+Lys為88；親水性平均數(shù)為-0.075，脂肪指數(shù)(AI)為95.23，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定系數(shù)(II)為47.13，表現(xiàn)為不穩(wěn)定狀態(tài)，由此我們可以推測(cè)其可能為不穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)。

圖1 紫花苜蓿MsSOS1基因cDNA克隆過(guò)程的PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis in the process of MsSOS1 cDNA cloning注：M為DL5000 DNA Marker;1為RT-PCR產(chǎn)物；2為5′-RACE PCR產(chǎn)物；3為3′-RACE PCR產(chǎn)物；4為MsSOS1基因全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物Note：M:DL5000 DNA Marker;1:RT-PCR product of MsSOS1 gene;2:5′-RACE PCR product of MsSOS1 gene;3:3′-RACE PCR product of MsSOS1 gene;4:The full-length PCR product of MsSOS1 gene

圖2 紫花苜蓿MsSOS1基因cDNA及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of MsSOS1注：左側(cè)和右側(cè)的數(shù)字分別代表核苷酸和氨基酸位點(diǎn)，綠色區(qū)域?yàn)槠鹗济艽a子(ATG)和終止密碼子(TGA)，黃色區(qū)域代表3′及5′非編碼區(qū)，下劃線為預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)域Note:The nucleotide sequences and amino acid residues are indicated by numbers of the left and right. The start codon(ATG) and the stop codon(TGA) were green shaded. The red shaded was 3′-UTR and 5′-UTR;The underline was predictive transmembrane region

2.3.2紫花苜蓿MsSOS1蛋白的同源性分析 與其他植物SOS1蛋白的同源性比較結(jié)果顯示，紫花苜蓿MsSOS1蛋白與鷹嘴豆(Cicerarietinum)、大豆(Glycinemax)、羽扇豆(Lupinusangustifolius)、花生(Arachisipaensis)、葡萄(Vitisvinifera)等的同源性相對(duì)較高(表2)，由此可以確定該序列確實(shí)是紫花苜蓿SOS1基因，命名為MsSOS1。

表2 紫花苜蓿SOS1蛋白與其它植物SOS1蛋白的同源性分析Table 2 Homology analysis of the MsSOS1 withSOS1 from some higher plants

2.3.3紫花苜蓿MsSOS1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 對(duì)紫花苜蓿MsSOS1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊組成(圖3)，其中以α-螺旋為主，占46.22%；其次是無(wú)規(guī)則卷曲，占37.25%；β-轉(zhuǎn)角含量最少，僅占5.01%。

2.3.4紫花苜蓿MsSOS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析 運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)MsSOS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿MsSOS1蛋白的N-端含有NhaP、Na+/H+Exchanger結(jié)合位點(diǎn)和b-cpal、Na+/H+Exchanger superfamily等保守結(jié)構(gòu)域，C-端含有cNMP_binding結(jié)合位點(diǎn)和Crp、CAP_ED、CAP_ED superfamily、Crp superfamily等保守結(jié)構(gòu)域，表明該基因應(yīng)該是Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員(圖4)。

2.3.5紫花苜蓿MsSOS1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析 對(duì)紫花苜蓿MsSOS1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MsSOS1蛋白的N端和C端均位于細(xì)胞外，含有4個(gè)跨膜區(qū)域，其跨膜區(qū)氨基酸序列位置分別為29-51，63-85，100-118，138-160(圖5)；對(duì)信號(hào)肽位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿MsSOS1蛋白無(wú)信號(hào)肽位點(diǎn)存在(圖6)。

圖3 MsSOS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted secondary structure for MsSOS1 protein

圖4 MsSOS1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Fig.4 The conserved domains of the MsSOS1 protein

圖5 MsSOS1蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.5 Analysis of transmembrane helicesof MsSOS1 protein

圖6 MsSOS1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析NN-法Fig.6 Analysis and prediction of signal peptideof MsSOS1 based on NN-method

2.3.6紫花苜蓿MsSOS1蛋白的疏水性分析 運(yùn)用ProtScale程序?qū)ψ匣ㄜ俎sSOS1蛋白的疏水性進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)該蛋白中含有疏水區(qū)域，N-末端具有4個(gè)跨膜區(qū)，C-末端有一個(gè)很長(zhǎng)的親水性尾部，面向細(xì)胞膜內(nèi)腔(圖7)，這與先前報(bào)道過(guò)的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、獐茅(Aeluropuslittoralis)的SOS1蛋白的研究結(jié)果相似[26-27,30]。

圖7 MsSOS1蛋白疏水性分析Fig.7 Analysis of hydrophobility of MsSOS1 protein

2.3.7紫花苜蓿MsSOS1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 對(duì)紫花苜蓿MsSOS1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：denoplasmic reticulum(47.8%) > plasma membrane(26.1%) > nuclear(4.3%) > vesicles of secretorysystem(4.3%) > vacuolar(4.3%) > mitochondrial(4.3%) > cytoplasmic(4.3%) > Golgi(4.3%)，由此可以預(yù)測(cè)紫花苜蓿MsSOS1蛋白可能主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

2.3.8紫花苜蓿MsSOS1蛋白的氨基酸序列多重比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 將紫花苜蓿MsSOS1蛋白序列同Genbank上查找的其他已知物種的SOS1蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MsSOS1蛋白與豆科植物鷹嘴豆(Cicerarietinum)CaSOS1(XM_004504555.2)、大豆(Glycinemax)GmSOS1(NM_001258010.1)和綠豆(Vignaradiata)VrSOS1(KC855193.1)的同源性非常近，在85%以上，分別為91%、87%、85%(圖8)。

利用MEGA5.0軟件對(duì)紫花苜蓿MsSOS1蛋白同其他植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿MsSOS1蛋白與已經(jīng)報(bào)道的具有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸功能的幾種植物的同源性很近，而與定位在內(nèi)膜系統(tǒng)上的NHX類的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源性較低(圖9)，這些都可以說(shuō)明MsSOS1可能是質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS1)，可能與紫花苜蓿的耐鹽性有著密切的關(guān)系。

圖8 紫花苜蓿MsSOS1與其它植物SOS1蛋白的多重比對(duì)分析Fig.8 Multiple alignment analysis of MsSOS1 with other plant SOS1 proteins注：多重比對(duì)采用DNAMAN軟件進(jìn)行。Ms：紫花苜蓿Medicago sativa；Ca：鷹嘴豆Cicer arietinum；Ai：花生Arachis ipaensis；Gm：大豆Glycine max；Vr：綠豆Vigna radiata。橫線表示跨膜區(qū)Note:The sequence were aligned with DNAMAN software;The transverse line was transmembrane helices

圖9 紫花苜蓿MsSOS1與其他植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.9 Phylogenetic analysis of MsSOS1 in Medicago sativa with closely related Na+/H+antiporters from different plant species

2.4 紫花苜蓿MsSOS1基因的組織特異性表達(dá)分析

對(duì)MsSOS1基因在同一株紫花苜蓿不同組織中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析并作圖(圖10)，以花中MsSOS1基因的表達(dá)量為對(duì)照發(fā)現(xiàn)，在正常生長(zhǎng)條件下，MsSOS1基因在紫花苜蓿各組織中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高，且明顯高于其它組織，是對(duì)照的11.9倍，葉中的表達(dá)量次之，是對(duì)照的6.7倍，莖中的表達(dá)量不是很明顯，但也達(dá)到了對(duì)照的3.4倍(圖10)。由此結(jié)果可以看出，MsSOS1基因在紫花苜蓿的各個(gè)器官中均有表達(dá)，只是表達(dá)峰度不同。

圖10 MsSOS1基因的組織表達(dá)特異性Fig.10 Organ-specific expression pattern of MsSOS1

2.5 不同非生物脅迫下紫花苜蓿MsSOS1基因的表達(dá)分析

為了研究紫花苜蓿MsSOS1基因是否受非生物脅迫的誘導(dǎo)，分別對(duì)紫花苜蓿幼苗進(jìn)行了不同的非生物脅迫處理，分析不同組織中MsSOS1基因的表達(dá)情況。

2.5.14℃脅迫下MsSOS1基因在紫花苜蓿中的表達(dá)量分析 4℃脅迫條件下，以0 h為對(duì)照分析MsSOS1基因在不同時(shí)間段的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因受4℃脅迫誘導(dǎo)比較明顯。葉片中MsSOS1基因的表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，且于8 h達(dá)到最大值；莖和根中的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)，但均低于對(duì)照(圖11)。

2.5.2PEG6000脅迫下MsSOS1基因在紫花苜蓿中的表達(dá)量分析 25% PEG6000模擬干旱條件下，以0 h為對(duì)照分析MsSOS1基因在不同時(shí)間段的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因受PEG6000誘導(dǎo)表達(dá)比較明顯，在根、莖和葉中均有不同程度的表達(dá)(圖12)。在葉中，隨著PEG誘導(dǎo)時(shí)間的變化，MsSOS1基因的表達(dá)呈逐漸上升的趨勢(shì)，于72 h表達(dá)量顯著增加且達(dá)到最大表達(dá)量，是對(duì)照的7.5倍；隨著PEG脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，MsSOS1基因在根和莖中的表達(dá)量基本上都是出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，根中的表達(dá)量于12 h達(dá)到最大值，是對(duì)照的3.67倍；莖中的表達(dá)量于24 h達(dá)到最大值，是對(duì)照的8.23倍。

圖11 MsSOS1基因在4℃脅迫下的表達(dá)模式分析Fig.11 Expression pattern of MsSOS1 in response to 4℃ stress

圖12 MsSOS1基因在PEG脅迫下的表達(dá)模式Fig.12 Expression pattern of MsSOS1 in response to PEG stress

2.5.3脫落酸(ABA)脅迫下MsSOS1基因在紫花苜蓿中的表達(dá)量分析 以0 h為對(duì)照分析MsSOS1基因在ABA脅迫下的不同時(shí)間段的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ABA誘導(dǎo)下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，MsSOS1基因主要在莖和葉中表達(dá)(圖13)，在葉中，MsSOS1基因的表達(dá)量在12 h達(dá)到最低值，24 h達(dá)到最大值，是對(duì)照的3.14倍；在莖中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MsSOS1基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且于24 h達(dá)到最大值，是對(duì)照的9倍；ABA處理對(duì)MsSOS1基因在根部的表達(dá)影響不顯著，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量幾乎不變。

3 討論

目前，很多研究已經(jīng)確定了從藍(lán)細(xì)菌到真菌、從藻類到高等植物中耐鹽性的決定因素。在正常條件下，植物體細(xì)胞質(zhì)中維持比較高的K+/Na+，而當(dāng)它受到鹽脅迫時(shí)，植物就會(huì)啟動(dòng)體內(nèi)多種適應(yīng)機(jī)制如傳感、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和代謝途徑等來(lái)適應(yīng)這些不利環(huán)境。為了了解這些機(jī)制中有哪些部分可以提高植物對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性，我們重點(diǎn)研究了紫花苜蓿中與鹽度耐受性相關(guān)的主要基因的分離、鑒定和表達(dá)模式分析。在本研究中，我們克隆得到了紫花苜蓿MsSOS1基因的全長(zhǎng)序列并對(duì)其進(jìn)行了序列和表達(dá)分析。紫花苜蓿MsSOS1蛋白N-端具有4個(gè)高度同源的、具有水溶性特征的、主要負(fù)責(zé)Na+轉(zhuǎn)運(yùn)的功能結(jié)構(gòu)域，這與前人所報(bào)道的一般具有10～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域有所不同，這可能是由于物種之間的差異所造成的；C-端是可以確定其確實(shí)是屬于參與細(xì)胞內(nèi)Na+調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的高度親水的調(diào)控結(jié)構(gòu)域，末端還有一個(gè)很長(zhǎng)的、面向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)腔的親水性尾部，推測(cè)它可能是通過(guò)與逆境相關(guān)的調(diào)控因子發(fā)生互作來(lái)提高植物的抗性；另外，C-末端還存在1個(gè)SOS1蛋白的活性調(diào)節(jié)區(qū)(即磷酸化調(diào)節(jié)位點(diǎn))，這與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和獐茅(Aeluropuslittoralis)等的SOS1蛋白結(jié)構(gòu)相似[26-27,31]，只是不同的物種之間存在一些差異。

圖13 MsSOS1基因在ABA處理下的表達(dá)模式Fig.13 Expression pattern of MsSOS1 in response to ABA treatment

對(duì)編碼后的MsSOS1蛋白序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與已經(jīng)報(bào)道的高等植物的SOS1基因蛋白序列相似度比較高；通過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白與豆科植物鷹嘴豆(Cicerarietinum)、大豆(Glycinemax)等豆科植物的SOS1蛋白的同源性比較高，與其它科屬植物的同源性比較低，說(shuō)明SOS1蛋白在不同的物種之間雖然具有較高的保守性，但也存在一定的差異；但是，將其與模式植物擬南芥相比，同源性相對(duì)較低，說(shuō)明這兩種蛋白之間的差異較大，由此可以推測(cè)它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上也可能會(huì)存在不同的差異[32]，這也就需要我們通過(guò)進(jìn)一步的功能表達(dá)分析研究該基因在耐鹽性狀方面的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行鑒別。另外，已有研究報(bào)道SOS1基因在植物的耐鹽方面起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)SOS1基因超表達(dá)可以使植物的耐鹽性增強(qiáng)[47]，這也預(yù)示著紫花苜蓿的MsSOS1基因在植物的耐鹽方面可能也起著重要的作用。

采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法對(duì)紫花苜蓿MsSOS1基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在紫花苜蓿生育期的根、莖、葉、花中均有表達(dá)，這與擬南芥AtSOS1[21]和菊苣CiSOS1[48]在根和地上部分均有表達(dá)的結(jié)果相一致。從圖11中也可以看到，紫花苜蓿MsSOS1基因在生育期的表達(dá)峰值為：根>葉>莖>花，具有根部表達(dá)的特性，它主要表現(xiàn)為根部組織通過(guò)對(duì)紫花苜蓿MsSOS1基因的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)的方法，將根系中多余的Na+排除體外，降低根中Na+濃度來(lái)抵御Na+對(duì)植物體本身的毒害作用。對(duì)紫花苜蓿MsSOS1基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，不同的非生物脅迫表達(dá)模式有所區(qū)別，Munns等[49]研究認(rèn)為植物激素ABA是植物適應(yīng)鹽脅迫過(guò)程最初的信號(hào)物質(zhì)，在植物應(yīng)答鹽脅迫的過(guò)程中具有重要的作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，ABA處理植株能增強(qiáng)其在鹽脅迫條件下的適應(yīng)能力[50]，Shi等研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtSOS1基因在ABA處理下表達(dá)量沒(méi)有影響，而在本研究中，MsSOS1基因在根中的表達(dá)影響不明顯，主要在莖和葉中表達(dá)，莖中的表達(dá)相對(duì)比較明顯，推測(cè)該基因可能具有在莖維管束薄壁細(xì)胞表達(dá)的特異性[51]；本研究中，MsSOS1基因還受到PEG脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，無(wú)論是在根還是在莖和葉中均有不同程度的表達(dá)，與Song等對(duì)大島野路菊(Chrysanthemumcrassum)CcSOS1基因的研究相一致[52]，說(shuō)明該基因也可能參與了紫花苜蓿的抗旱過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究從豆科植物中苜1號(hào)紫花苜蓿中克隆得到一個(gè)MsSOS1基因，對(duì)其進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因包含一個(gè)2 580 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼859個(gè)氨基酸；蛋白序列與豆科植物鷹嘴豆的氨基酸序列的同源性最高，為91%，進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆谫|(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。另外，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)具有組織表達(dá)特異性，且在根中的表達(dá)量最大，其次是莖和葉；4℃、PEG和ABA等非生物脅迫都會(huì)誘導(dǎo)MsSOS1基因的表達(dá)，只是表達(dá)峰度不同，推測(cè)該基因可能在紫花苜蓿的抗逆分子機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。這對(duì)于了解豆科植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因參與植物抗逆性的分子機(jī)制有了一定的了解，并為深入解析紫花苜蓿MsSOS1基因的功能和培育抗逆品種提供了良好的理論基礎(chǔ)。