李小英 郭 瀟 周 潔 錢瑤瑤 張必超 楊慈清,2△

(1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 2 河南省醫(yī)用組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新鄉(xiāng) 453003)

在哺乳動物大腦皮層發(fā)育過程中,膠質(zhì)細(xì)胞的突起向外延伸構(gòu)成支架結(jié)構(gòu),眾多的原始神經(jīng)細(xì)胞沿此支架做變形運(yùn)動由內(nèi)向外遷移到正常的位置,同時完成分裂到分化的過程,在此過程中reelin蛋白在大腦皮層結(jié)構(gòu)正常形成過程中起到關(guān)鍵作用[1]。Reelin幾乎存在于所有的脊椎動物,人類reelin基因位于染色體7q22,其表達(dá)產(chǎn)物為3641個氨基酸殘基,組成了一個巨大的分子量約為388kD的糖蛋白[2]。Reelin表達(dá)缺失的小鼠稱為reeler鼠,研究表明,和reelin蛋白有關(guān)的任一自然突變或定向突變都會影響小鼠大腦皮層分層結(jié)構(gòu)的形成,有研究表明,3種不同reelin基因型小鼠其神經(jīng)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)彼此之間在腦的多個部位存在差別[3]。在reelin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上,reelin及其蛋白受體包括極低密度脂蛋白受體(very low density lipoprotein receptor, VLDLR)和載脂蛋白E受體2(apolipoprotein E receptor 2, ApoeR-2)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的蛋白磷酸化(disabled-1, Dab1)過程中有任一者發(fā)生突變都將導(dǎo)致胚胎腦的發(fā)育異常[4]。小鼠常在出生后20～30d內(nèi)死亡。也有研究表明,人類的各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病與reelin的突變及異常表達(dá)有關(guān),如自閉癥患者reelin 基因5′端出現(xiàn)異常的GGC重復(fù)序列[5-6]。Reelin在精神分裂癥患者皮層中間神經(jīng)元中表達(dá)降低[7]。本研究擬通過特異性抗體對神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記,對3種不同reelin基因型小鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)存在的差異進(jìn)行比較分析,為reelin在小鼠大腦皮層各層結(jié)構(gòu)形成過程中的作用研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

Reelin雜合子小鼠(西北農(nóng)林科技大學(xué)趙善廷實(shí)驗(yàn)室贈);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, Roche);兔抗Foxp1一抗、兔抗Tbr-1一抗、兔抗NeuN一抗、鼠抗GFAP一抗(Abcam公司);Cy3標(biāo)記山羊抗兔二抗、FITC標(biāo)記山羊抗鼠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本Nikon);CM1850冰凍切片機(jī)(德國Leica)。

1.2 材料收集

取出生后10d經(jīng)PCR鑒定后確定基因型小鼠,4.3% 的水合氯醛麻醉后,用4%的多聚甲醛經(jīng)心灌注,剝離小鼠的全腦,將其放到4%多聚甲醛中,置保溫盒4℃ 在搖床上搖晃過夜,第2天取出組織吸干多余的液體,將組織放到18%的蔗糖溶液中,在保溫盒中搖床上搖晃過夜。等到腦組織沉淀到管底部時取出組織,吸干組織上的多余液體。經(jīng)OCT包埋,液氮冷凍后置-80℃ 保存?zhèn)溆?。切片時取出包埋組織,在冰凍切片機(jī)上冠狀連續(xù)切片,切片厚度設(shè)置為20μm,每次10～20張載玻片,根據(jù)組織大小每張片子上循環(huán)貼5～10列,2～3行,保持37℃烤片機(jī)烤片30min,最后保存在-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 熒光免疫組織化學(xué)

-80℃冰箱中取出切片,37℃烤片機(jī)上進(jìn)行烤片10min。1000ml燒杯中放入濃度為0.01mol/L,酸堿度為pH=6.0的檸檬酸鹽緩沖液,將燒杯放到微波爐中加熱沸騰;將切片置于切片架上,將其放入已經(jīng)沸騰的緩沖液中,然后微波低火處理30min;取出燒杯,取出組織切片,然后將組織切片放在免疫組織化學(xué)濕盒中,用蒸餾水沖洗2次,之后用TBS(Tris-buffered saline, TBS)洗3次,每次5min。用含0.1% Triton X-100的1×TBS孵育5min,最后倒掉組織切片上的溶液,并用吸水紙將殘留的溶液擦干,分別滴加合適濃度的第一抗體兔抗Foxp1、Tbr-1和兔抗NeuN(按照1∶500 的濃度用一抗稀釋液稀釋,稀釋液配方： 2%的山羊血清+4%牛血清白蛋白+0.3% Triton X-100+0.1%的疊氮鈉溶解于PBS中),一張切片300μl,4℃ 孵育過夜。次日,用1×TBS液體洗3次,每次5min,倒掉組織切片上的溶液后,避光滴加針對一抗的合適濃度Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗(按照1∶500的濃度用二抗稀釋液稀釋,稀釋液配方： 2%的山羊血清+4%牛血清白蛋白+0.1%的疊氮鈉溶解于PBS中),4℃孵育6h。再用1×TBS液體洗3次,每次5min。避光條件下每張組織切片上加入300μl DAPI染色劑,染色10min,TBS洗3次,每次5min,封片劑封片后熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照,進(jìn)行GFAP(1∶500)雙標(biāo)的過程與以上方法相同,滴加二抗為FITC標(biāo)記山羊抗鼠二抗。

1.4 圖像處理分析

用Photoshop CS3軟件處理圖片,可將兩種染色同位疊加在一起。

2 結(jié)果

2.1 不同reelin基因型小鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)的差異(圖1，見封底)

對3種基因型小鼠大腦皮層DAPI染色結(jié)果顯示(圖1A、G、M),野生型小鼠(reelin+/+;1A)和雜合基因型小鼠(reelin+/-;1G)的大腦皮層DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核分布具有典型層的結(jié)構(gòu),但是各層細(xì)胞核密度高低存在差異,而reeler型小鼠(reelin-/-;1M)大腦皮層不具有典型的層的結(jié)構(gòu),細(xì)胞核呈彌散的分布。

2.2 FoxP1、NeuN、Tbr-1和GFAP在不同reelin基因型小鼠大腦皮層表達(dá)與分布的差異

FoxP-1因子(Forhead box p1)即叉頭框因子P1特異性的標(biāo)記新皮質(zhì)第Ⅴ～Ⅵ層神經(jīng)元,與FoxP-2相似,與語言能力的發(fā)展有關(guān)。Tbr-1是T-box基因家族成員之一,是一種哺乳動物腦特異性的標(biāo)記物;NeuN是一種標(biāo)記成熟神經(jīng)元的核內(nèi)蛋白標(biāo)記物,在小鼠胚胎發(fā)育的17d開始,大腦皮層就有NeuN陽性表達(dá)的細(xì)胞[8];GFAP被廣泛認(rèn)為是成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物,在小鼠胚胎發(fā)育的14d開始,在大腦皮質(zhì)就開始有GFAP陽性標(biāo)記的細(xì)胞[9]。以上標(biāo)記物都被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能性研究。因此,在本實(shí)驗(yàn)中用以上標(biāo)記物對不同reelin基因型小鼠大腦皮層進(jìn)行了標(biāo)記。

在FoxP-1熒光免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示,野生型(reelin+/+,圖1B)和雜合型(reelin+/-,圖1H)兩種基因型小鼠的FoxP-1均在皮層的淺層表達(dá),主要分布在皮層板(cortical plate, CP)-室管膜區(qū)(ventricular zone, VZ)區(qū),在邊緣帶(marginal zone, MZ)區(qū)不存在其表達(dá),特別是在reelin+/-小鼠大腦皮層中,室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)區(qū)的表達(dá)比reelin+/+型的更高,但是在reelin基因敲除(reelin-/-,圖1N)小鼠大腦皮層中,FoxP-1的表達(dá)均勻分布在各區(qū),特別在MZ區(qū),野生型和雜合型小鼠大腦皮層中不表達(dá)的區(qū)域也有大量標(biāo)記的細(xì)胞。進(jìn)一步用NeuN標(biāo)記成熟神經(jīng)元,可以看到野生型(reelin+/+,圖1C)和雜合型(reelin+/-,圖1I)兩種基因型小鼠的NeuN陽性細(xì)胞主要分布在CP和SVZ區(qū)。而reelin基因敲除小鼠(reelin-/-)在CP和SVZ區(qū)沒有NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元,而少數(shù)標(biāo)記細(xì)胞只見于MZ區(qū)(圖1O)。Tbr-1標(biāo)記的細(xì)胞中,可以看到,在野生型(圖1D)和雜合子(圖1J)中,Tbr-1標(biāo)記細(xì)胞主要分布在CP-SVZ區(qū),而在雜合子(圖1J)中SVZ區(qū)標(biāo)記的細(xì)胞更多,但是在reelin基因敲除小鼠(reelin-/-)中Tbr-1標(biāo)記的細(xì)胞只在MZ區(qū)(圖1P),其他區(qū)沒有被標(biāo)記的細(xì)胞。進(jìn)一步用GFAP標(biāo)記了膠質(zhì)細(xì)胞,結(jié)果顯示(圖1E、K、Q),在野生型(圖1E)和雜合子(圖1K)中,GFAP標(biāo)記的膠質(zhì)細(xì)胞在VZ區(qū)有規(guī)律的分布,但是在reelin基因敲除小鼠(圖1Q)中GFAP標(biāo)記的細(xì)胞雜亂分布在各區(qū),沒有規(guī)律可循,將Tbr-1和GFAP標(biāo)記結(jié)果疊加(圖1F、L、R)后可以更清楚看到3種不同基因型小鼠大腦皮層各自被標(biāo)記細(xì)胞的差異。

3 討論

大量研究已經(jīng)表明一系列神經(jīng)精神疾病如阿爾茨海默病[10]、精神分裂癥[11]、孤獨(dú)癥[12]、癲癇[13]等均與reelin蛋白表達(dá)的異常有關(guān),這些疾病產(chǎn)生的具體機(jī)制以及與reelin之間的關(guān)系尚不明確,這也提示reelin可能具有更為復(fù)雜的功能,因此,未來reelin可能作為神經(jīng)系統(tǒng)這些疾病的診斷、治療靶點(diǎn)。

本研究對不同reelin基因型小鼠的大腦皮層的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在小鼠大腦皮層形成過程中reelin的表達(dá)對其結(jié)構(gòu)的形成具有重要影響。在reelin基因敲除重合子中,其皮層的結(jié)構(gòu)模糊,不具有典型的層的結(jié)構(gòu),大量文獻(xiàn)表明reeler小鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)發(fā)生了反轉(zhuǎn)[14-15],本研究中同樣觀察到reelin基因敲除重合子中皮層異常,與報道的結(jié)果一致。關(guān)于reelin在大腦皮層形成過程中的作用也是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中研究的熱點(diǎn)[16]。許多研究表明reelin在神經(jīng)元遷移中具有雙重角色,具有吸引和阻止神經(jīng)元遷移的雙重作用[17]。在本實(shí)驗(yàn)中也對reelin雜合子小鼠大腦皮層形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了染色和標(biāo)記。通過對比顯示,在雜合子中,皮層具有層的結(jié)構(gòu),但是與野生型相比,Fox-P1、NeuN和Tbr-1標(biāo)記的細(xì)胞所在部位并不是完全相同,該結(jié)果與Badea等[3]的結(jié)果保持一致。因此,也說明在雜合子中由于reelin的異常表達(dá)對其產(chǎn)生相應(yīng)的影響。由于reelin敲除重合子小鼠存活能力極差,如果飼養(yǎng)不周,在出生后20～30d就會死亡,因此,本實(shí)驗(yàn)在出生后10d進(jìn)行基因型鑒定并完成實(shí)驗(yàn)。Reeler鼠不但生活能力差并伴有許多組織器官發(fā)育的缺陷,很難作為疾病動物模型,而reelin雜合型小鼠生存能力較強(qiáng),并表現(xiàn)出一些列神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的特征,所以被廣受關(guān)注。因此,對reelin功能的研究不但只是在神經(jīng)系統(tǒng)中單純的調(diào)控功能,更重要的是其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的功能研究,本研究通過對3種不同reelin基因型小鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)的比較,充分說明了reelin在大腦皮層形成過程中對層形成存在影響,也為不同reelin基因型小鼠作為疾病模型的研究提供了依據(jù)。