陳國銘，湯順莉，黃 雁，於菁雯，鄺梓君，林洪榮，趙金龍，劉韻韻， 張培嬋，陳子茵，江曉兵

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院， 廣州 510405； 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405； 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

骨碎補(bǔ)為骨科常用中藥，是水龍骨科(Polypodiaceae)多年生蕨類植物槲蕨Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm.的干燥根莖，始載于《藥性論》，味苦、性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨之功效，主治跌仆閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動，外用消風(fēng)祛斑，可治療斑禿、白癜風(fēng)等[1]。現(xiàn)代藥理表明，骨碎補(bǔ)具有良好的促進(jìn)骨折愈合、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、促進(jìn)牙齒生長、防治中毒性耳聾、降血脂等活性。中藥是一個復(fù)雜的化學(xué)成分體系，其中活性成分通過多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的整合調(diào)控產(chǎn)生協(xié)同功效[2]。因中藥成分復(fù)雜，數(shù)量龐大，難以深入研究，但中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則為此提供了新的思路和視角[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“化合物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)研究藥物，其研究策略的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)的整體觀念和辨證論治理論不謀而合。因此本課題基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究“骨碎補(bǔ)”，以期明確骨碎補(bǔ)中醫(yī)療效的作用機(jī)制，并進(jìn)一步深入挖掘骨碎補(bǔ)的其他臨床應(yīng)用。

1 方法

1.1 骨碎補(bǔ)化合物分子庫的構(gòu)建

以中藥“骨碎補(bǔ)”為主題詞，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)中檢索出骨碎補(bǔ)所有化學(xué)成分共142個。考慮到篩選條件應(yīng)為決定藥物口服利用度以及成藥性優(yōu)劣的關(guān)鍵參數(shù)，故采納TCMSP推薦的預(yù)測策略，將口服利用度(OB)≥50%和類藥性(DL)≥0.18設(shè)定為篩選條件,將數(shù)據(jù)庫中具有較高活性的化合物篩選出來,最終得到符合條件的化合物共7個。

1.2 化合物-靶標(biāo)-疾病的藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在TCMSP上全面檢索與7個活性化合物相關(guān)的潛在靶標(biāo)，利用Cytoscape 3.5.1軟件將7個候選化合物與其潛在靶標(biāo)構(gòu)建成一個體現(xiàn)候選化合物-靶點(diǎn)相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)得出的潛在靶點(diǎn)在TCMSP中檢索出相關(guān)的疾病，進(jìn)而可繪制靶點(diǎn)-疾病相互作用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物篩選結(jié)果

圖1 活性化合物結(jié)構(gòu)式

表1圖1顯示，通過數(shù)據(jù)庫檢索共收集到骨碎補(bǔ)成分化合物142個，設(shè)定OB≥50%和DL≥0.18進(jìn)行篩選，最終得到7個匹配的活性化合物，其中4個黃酮類化合物，2個苷類化合物，1個酯類化合物。篩選出的化合物均同時具有較高的OB和DL值，如MOL005190(OB=71.79%，DL=0.24)、MOL009078(OB=62.65%，DL=0.51)，目前已有不少文獻(xiàn)報道黃酮類化合物治療骨質(zhì)疏松癥確有一定療效，如其中柚皮素通過調(diào)控CTSK、Wnt/β-catenin 等信號通路發(fā)揮作用[4-5]。OB、DL和degree值排名第一的3個活性分子分別為eriodictyol(圣草苷)、davallioside A_qt(骨碎補(bǔ)苷A_qt)和naringenin(柚皮素)。

表1 通過OB-DL值預(yù)測篩選出骨碎補(bǔ)有效成分信息

2.2 有效化合物—潛在靶標(biāo)的作用網(wǎng)絡(luò)分析

本研究中，筆者將經(jīng)過 OB 和 DL 篩選的 7個活性化合物及其潛在的靶標(biāo)相連來構(gòu)建分子-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。活性化合物-潛在靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)包含62個節(jié)點(diǎn)(6 個化合物和 56個潛在靶標(biāo)) 和 73條邊，另化合物MOL009087(marioside_qt)因在數(shù)據(jù)處理過程中發(fā)現(xiàn)，其在該數(shù)據(jù)庫中還未有相關(guān)的靶點(diǎn)，故而在構(gòu)建候選化合物-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中，只顯示相關(guān)的6個化合物。在網(wǎng)絡(luò)圖中，紅色節(jié)點(diǎn)代表候選化合物，黃色和灰色節(jié)點(diǎn)表示藥物靶標(biāo)，而每條邊則表示候選化合物分子與靶標(biāo)間的相互作用關(guān)系。在網(wǎng)絡(luò)中，一個節(jié)點(diǎn)(node)的度值(degree)表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線條數(shù)，每一個化合物的度值即表示候選化合物分子所擁有的靶點(diǎn)數(shù)目; 而每一個靶點(diǎn)的度值則代表著相應(yīng)靶點(diǎn)所有相關(guān)活性化合物分子的數(shù)目。

圖2顯示，通過對分子-靶點(diǎn)相互作用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度值進(jìn)行統(tǒng)計和排列，將網(wǎng)絡(luò)圖重構(gòu)成分子-靶點(diǎn)排序網(wǎng)絡(luò)圖，并使用分層染色使其一目了然。通過排序網(wǎng)絡(luò)圖可以發(fā)現(xiàn)，參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的化合物作用的不同通路以及頻次高低，通過分析通路和頻次，可以估測和評價候選化合物在藥物起效機(jī)制中的作用。圖中各節(jié)點(diǎn)面積大小與其度值成正比，面積越大表明其能作用于更多的其他節(jié)點(diǎn)。黃色節(jié)點(diǎn)代表能夠被2個或2個以上骨碎補(bǔ)活性化合物作用的人體靶點(diǎn)，灰色節(jié)點(diǎn)代表只被一個骨碎補(bǔ)活性成分作用的孤立靶點(diǎn)。

圖2 骨碎補(bǔ)活性化合物與其靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖2顯示，面積最大的節(jié)點(diǎn)是骨碎補(bǔ)活性分子MOL004328(naringenin)，擁有最多的潛在靶標(biāo)(37 個)，其次是MOL000492((+)-catechin)，有11個潛在靶標(biāo)，MOL001978(Aureusidin)有9個潛在靶標(biāo)。這些度值高的藥物分子有可能在骨碎補(bǔ)藥理功能中發(fā)揮較為重要的作用。在56個潛在靶標(biāo)中，有9個靶標(biāo)至少與2個化合物分子連接。圖2顯示，紅色節(jié)點(diǎn)正是通過這9個靶標(biāo)(黃色節(jié)點(diǎn))間接相連，提示中藥各成分之間很可能是通過此種方式起協(xié)同作用。有47個靶標(biāo)只與 1 個候選化合物分子相關(guān)。利用Cytoscape自帶的強(qiáng)大網(wǎng)絡(luò)分析工具(Network Analyzer)對骨碎補(bǔ)活性化合物-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行無向性(Undirected)拓?fù)鋵W(xué)分析表明，網(wǎng)絡(luò)中每個候選化合物都至少與3個潛在靶標(biāo)連接，網(wǎng)絡(luò)的中介中心度為0.587，共有3787條最短通路，典型通路長度2.952，平均度值2.355，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性2.058，說明骨碎補(bǔ)中含有的候選化合物分子可能作用于整個生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，而不單一作用于某一個潛在靶標(biāo)，從而更進(jìn)一步說明中草藥作用的整體性與復(fù)雜性。在7個化合物中，度值最高為naringenin即柚皮素(37)，其為黃酮類化合物，具有抗骨質(zhì)疏松作用，可通過影響破骨相關(guān)基因表達(dá)抑制破骨細(xì)胞成熟和分化[6]。OB 值最高的為eriodictyol即圣草酚(OB=71.79%)，其為黃酮類成分，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、改善糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的作用[7]，主要通過CTSK、Wnt/β-catenin 等信號通道起效。DL 最高的davallioside A_qt 即骨碎補(bǔ)苷A(DL=0.51)，但目前關(guān)于此化合物的研究甚少，為以后的研究提供了方向?，F(xiàn)將這3個化學(xué)成分具體介紹如下。

2.2.1 柚皮素(Naringenin) 柚皮素作為柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物，是一種廣泛存在于蕓香科植物中的二氫黃酮類化合物。國內(nèi)外藥理研究表明，柚皮素具有抗菌消炎、抗氧化、抗癌抗腫瘤、抗損傷、降血脂等多種藥理活性[8]。以往骨碎補(bǔ)活性單體成分調(diào)控骨質(zhì)疏松實驗的干預(yù)措施多為柚皮苷，但近年來不少動物實驗研究結(jié)果表明，柚皮素同樣具有明顯的抗骨質(zhì)疏松作用。如宋雙紅[9]、翟遠(yuǎn)坤等[10]的研究表明，柚皮素具有明顯的促骨形成活性，能夠促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)，保持骨密度。更有Pang，W Y等[11]體外實驗進(jìn)一步探究表明，柚皮素對成骨細(xì)胞促骨形成活性要優(yōu)于柚皮苷。吳新濤等[12]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素可能通過上調(diào) Bcl-2 表達(dá)、下調(diào) Bax、 Caspase-3 表達(dá)等機(jī)制對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡具有拮抗作用，同時柚皮素通過影響破骨細(xì)胞特異性基因TRAP、MMP-9、CATK、OPG/RANKL/RANK的表達(dá)，能夠明顯抑制破骨細(xì)胞分化和成熟，促使骨組織向成骨方向發(fā)展，這揭示了柚皮素作用于骨質(zhì)疏松癥的可能機(jī)制。

2.2.2 圣草苷(eriodictyol) 圣草苷是骨碎補(bǔ)中另一個主要的黃酮類活性成分。作為自由基受體及鏈終止劑的黃酮類化合物具有抗氧化活性，其抗氧化能力大小與羥基位置及羥化程度有重要關(guān)系?？寡趸钚宰顝?qiáng)的是B環(huán)上有鄰二酚羥基的黃酮[13]。由圣草苷的結(jié)構(gòu)式(見圖1)可知，圣草苷正是B環(huán)上具有鄰二酚羥基的黃酮，據(jù)此可以推測圣草苷是一種潛在的抗氧化活性很強(qiáng)的天然抗氧化劑。目前研究表明，圣草酚具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、改善糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的作用[7]。Song，F(xiàn)等[14]觀察到，Eriodictyol能夠通過抑制NFATc1活性和RANKL誘導(dǎo)NF-kB、MAPK、Ca2+信號通路來阻止RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成。Li、L等[15]通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)，圣草苷可以上調(diào)成骨分化過程中Runx2、COLI和BGP 3個標(biāo)志性基因的表達(dá)，此外圣草苷還可在一定程度上逆轉(zhuǎn)PD98059對細(xì)胞分化的抑制，起到抗骨質(zhì)疏松的作用。因此，圣草苷防治骨質(zhì)疏松癥和其他骨相關(guān)疾病的應(yīng)用前景廣闊。

2.2.3 骨碎補(bǔ)苷A_qt(davallioside A_qt) 目前對該化合物的研究較少，本研究通過分析化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)其較多的作用于凝血因子，與多種心血管疾病相關(guān)，可以作為未來實驗探究的一個方向。

2.3 潛在靶標(biāo)—相關(guān)疾病的作用網(wǎng)絡(luò)分析

圖3為根據(jù)潛在靶標(biāo)與相關(guān)疾病構(gòu)建而成的網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)圖中有56個靶標(biāo)和131種相關(guān)疾病共187個節(jié)點(diǎn)(紅色為靶點(diǎn)，白色為相關(guān)疾病)，節(jié)點(diǎn)大小與其自身度值成正比。在TCMSP上發(fā)現(xiàn)，活性化合物所涉及的靶點(diǎn)數(shù)目有 56個，而在靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)中只顯示34個相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白，由此可知，有22個靶標(biāo)在網(wǎng)絡(luò)中沒有相對應(yīng)的疾病，由此可推測骨碎補(bǔ)可能還存在尚未被發(fā)現(xiàn)的臨床應(yīng)用價值，提示可為之后全面挖掘骨碎補(bǔ)臨床應(yīng)用提供突破方向，發(fā)現(xiàn)其可用于治療的更多疾病。表2為潛在靶標(biāo)對應(yīng)相關(guān)疾病和骨碎補(bǔ)成分的度值，可以看出一個靶蛋白可以與許多疾病相關(guān)。靶標(biāo)與疾病度值前三位依次為前列腺素G/H合酶2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II、熱休克蛋白HSP 90。前列腺素G/H合酶2也稱環(huán)氧合酶(COX-2)，是前列腺素類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，它在動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后狹窄等血管炎性疾病的發(fā)展中扮演著重要角色[16]。前列腺素G / H合酶2的潛在靶標(biāo)度值最高為39，可見其治療疾病范圍最為廣闊，提示可能為骨碎補(bǔ)藥效機(jī)制的主要靶標(biāo)。李洋[17]等研究表明，BMP9在誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化過程中激活PI3K/Akt信號，可能與其促進(jìn)COX-2表達(dá)有關(guān),且COX-2抑制劑具有明顯延遲骨折愈合的不良反應(yīng)。COX2的表達(dá)水平以及其引起的PG分泌，會影響軟骨細(xì)胞形成和軟骨內(nèi)化骨，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞活性和骨形成。度值為22的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα，是DNA代謝過程中重要核酶，目前已成為許多抗癌藥物的作用靶點(diǎn)。熱休克蛋白HSP90是在生物體中廣泛存在的一種保守蛋白，其在生物體受到外界脅迫時起到分子伴侶作用，現(xiàn)代研究驗證，其具有延長細(xì)胞壽命、抑制細(xì)胞凋亡的作用。郭曉華等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HSP90與eNOS 結(jié)合增加NO合成釋放，可舒張血管，改善腎缺血，另外還有參與腫瘤免疫[19]、調(diào)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用[20]。Siebelt，M等[21]研究表明，軟骨細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的Hsp90合成在骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)病中起重要作用。劇烈運(yùn)動引起的生物力學(xué)應(yīng)力往往會增加大鼠關(guān)節(jié)軟骨中的Hsp90蛋白水平。Hsp90抑制和隨后增加的Hsp70水平，使軟骨細(xì)胞通過將糖胺聚糖(sGAG)量增加到基線以上來維持軟骨體內(nèi)平衡，保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)在身體活動期間增加生物力學(xué)影響。Hsp90抑制進(jìn)一步改善軟骨下骨厚度并減少滑膜巨噬細(xì)胞活化，說明HSP90抑制可潛在地保護(hù)或改善軟骨健康，并可能阻止OA的發(fā)展。HSP的缺失也可導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病[22]。此外，高度值的靶標(biāo)還有前列腺素G/H合酶1、Calmodulin、Coagulation factor Xa等，涉及的通路與疾病十分廣泛，由此可知潛在靶標(biāo)可作用于機(jī)體各個系統(tǒng)，包括心血管、內(nèi)分泌、神經(jīng)、生殖等系統(tǒng)，通過查閱相關(guān)現(xiàn)代藥理學(xué)研究文獻(xiàn)可充分驗證該觀點(diǎn)。

圖3 骨碎補(bǔ)活性化合物靶標(biāo)與相關(guān)疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

序號與化合物度值(degree)潛在靶標(biāo)(Target)名稱與疾病度值(degree)15Prostaglandin G/H synthase 2(前列腺素G / H合酶2)3921DNA topoisomerase II(DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II)2235Heat shock protein HSP 90(熱休克蛋白HSP 90)2243Prostaglandin G/H synthase 12051Calmodulin1761Coagulation factor Xa1673mRNA of PKA Catalytic Subunit C-al-pha1482Nuclear receptor coactivator 21493Estrogen receptor10102Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit, gamma iso-form8111Nitric oxide synthase, inducible7121Androgen receptor6131Caspase-36142Beta-lactamase5151Retinoic acid receptor RXR-alpha5162Peroxisome proliferator activated re-ceptor gamma4171Glycogen synthase kinase-3 beta4181RAC-alpha serine/threonine-protein kinase4191Apoptosis regulator Bcl-24201Carbonic anhydrase II3211Estrogen receptor beta3221Mitogen-activated protein kinase 143231Transcription factor p653241Glutathione S-transferase P3251Hyaluronan synthase 23261Heme oxygenase 13

表3 潛在標(biāo)靶相關(guān)疾病(degree≥3)出現(xiàn)頻次比較

3 討論

歷代文獻(xiàn)對骨碎補(bǔ)均有記載，如《藥性論》：“主骨中毒氣，風(fēng)血疼痛，五勞六極，口手不收，上熱下冷?！薄侗静輬D經(jīng)》：“治閃折筋骨損傷”“又用治耳聾”“亦入婦人血?dú)馑幱谩薄！侗静菥V目》：“治耳鳴及腎虛久泄、牙痛。”由此可見，中醫(yī)對藥物治療疾病的認(rèn)識具有整體觀，而基于大數(shù)據(jù)“多成分-多靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)正好打破了以往藥理學(xué)研究單一成分單一靶標(biāo)的缺點(diǎn)，是從整體認(rèn)識和探究中藥復(fù)雜成分治病機(jī)制的有力手段[23]。

現(xiàn)代《藥典》認(rèn)為，骨碎補(bǔ)具有“療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨”的功效。本次研究從骨碎補(bǔ)142個成分中篩選出7個具有高口服利用度和高類藥性的活性成分，相應(yīng)的有56個靶點(diǎn)和131種疾病，揭示了中醫(yī)“異病同治”的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，度值最高的成分柚皮素具有促進(jìn)骨細(xì)胞形成、抗骨質(zhì)疏松的作用，口服利用度最高的成分圣草酚具有抗炎、抗骨質(zhì)疏松的作用，這與中醫(yī)所講“止痛、強(qiáng)骨”有密切聯(lián)系。其重要靶標(biāo)亦被證實，與調(diào)節(jié)骨代謝和抗氧化相關(guān)，主要涉及癌癥、炎癥性疾病、神經(jīng)退行性病變、骨質(zhì)疏松、阿爾茨海默癥、腦損傷等疾病。中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨、骨生髓、腦為髓之?！保虼斯撬檠a(bǔ)“補(bǔ)腎”的功效可能與治療上述疾病相關(guān)。另外，從網(wǎng)絡(luò)中也能夠發(fā)現(xiàn)一些尚待深入研究的方向。

綜上所述，在大數(shù)據(jù)急速發(fā)展的生物信息時代，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥符合中醫(yī)所提倡的“整體觀”，該方法具有很大的潛力，值得探索。其研究結(jié)果具有一定的參考價值和提示作用，若要進(jìn)一步運(yùn)用于指導(dǎo)臨床，則需相關(guān)基礎(chǔ)和臨床實驗進(jìn)行驗證。