劉蓉芳，孫 玲，張杼惠，楊 婷，吳玲嬌，聶孝平，劉建和，毛以林Δ

(1. 江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529000； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，長沙 410005； 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 410007)

心康沖劑是我院心內(nèi)科臨床效方，前期實驗證明心康沖劑具有抗腎上腺素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)作用，能改善心臟病理結(jié)構(gòu)，保護(hù)心肌細(xì)胞，提高心功能作用[1]。

心肌纖維化(myocardial fibrosis MF)是心肌正常組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量積聚導(dǎo)致膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變的病理現(xiàn)象，是心功能不全的重要病理因素之一。定位于人類第10號染色體[2]的磷酸酶及張力蛋白同源基因PTEN，對成纖維細(xì)胞生長發(fā)揮著重要的作用，實驗證明PTEN在心肌纖維化的病理過程中起重要作用。PTEN通過水解PIP3第3位磷酸基團(tuán)對PI3K/AkT通路發(fā)揮抑制作用[3]，故PTEN基因缺失可激活A(yù)kT，從而誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞MMP表達(dá)升高[4]，引起心肌纖維化。探討中藥治療慢性心衰、抗心肌纖維化的效用機(jī)制，有利于指導(dǎo)臨床并提高臨床療效。因此本實驗欲探索心康沖劑抗心肌纖維化的機(jī)制，現(xiàn)報告如下：

1 材料

1.1 實驗動物

湖南斯克達(dá)實驗動物有限公司提供90只SPF級SD大鼠(實驗動物合格證號43004700025095)，體質(zhì)量150～180 g，雌雄各半。

1.2 藥品及儀器

芪藶強(qiáng)心膠囊(石家莊以嶺藥業(yè))，心康沖劑(湖南省中醫(yī)院中藥制劑室制備)，鹽酸阿霉素(深圳萬樂)，MMP-2(美國proteintech，Rabbit),actin(美國proteintech，Mouse)，AKT(美國CST，Rabbit),一抗試劑盒PTEN(美國proteintech，Rabbit)，二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(美國proteintech)，引物(上海生工合成)，LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國LEICA公司)，Motic B5 顯微攝像圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪)，便攜式彩色多普勒超聲儀(徐州大為DW-PF522)。

2 方法

2.1 動物分組及造模

大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法取10只為正常組，余下大鼠行阿霉素造模，造模方法參考文獻(xiàn)[5]，以阿霉素按1.5 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射，每周2次共7周。7周后以超聲心動圖檢測左心室短軸縮短率(LVFS)<30%[6]，即為心衰造模成功；模型成功后再按隨機(jī)數(shù)字表法分為阿霉素模型對照組(模型組)16只，心康沖劑等效劑量組(低劑組)16只，心康沖劑2倍等效劑量組(中劑組)16只，心康沖劑4倍等效劑量組(高劑組)16只，芪藶強(qiáng)心膠囊對照組(對照組)16只。

2.2 藥物制備及給藥

心康沖劑溶液配制：白參10 g，柴胡5 g，生黃芪30 g，升麻5 g，桂枝6 g，茯苓15 g，桔梗5 g，薏苡仁30 g，陳皮10 g，制附片10 g，大腹皮10 g，生姜皮10 g，砂仁6 g，經(jīng)湖南省中醫(yī)院藥劑科制成干燥顆粒后，配制成濃度分別為0.6 g/ml、1.2 g/ml、2.4 g/ml的溶液，分別設(shè)為心康沖劑低、中、高劑量組，芪藶強(qiáng)心溶液濃度配置為0.073 g/ml，設(shè)置為對照組，大鼠給藥劑量按人和動物體表面積折算[7]，灌胃量=給藥劑量/各組相應(yīng)溶液濃度，每次灌胃約1～2 ml。正常組、模型組給予等量生理鹽水灌服，每天1次。8周后實驗結(jié)束進(jìn)行取材。

2.3 指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 Masson染色及膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)測定 石蠟切片厚4～5 μm，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、水洗后用Weigert蘇木精液染核5～10 min，依次鹽酸酒精分化、蒸餾水漂洗、酸性麗春紅染5～10 min。再用2%冰醋酸水溶液浸泡數(shù)秒，l%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，亮綠液染5 min，最后依次用梯度脫水，二甲苯透明、封片。應(yīng)用Image-Pro 6.2圖像分析軟件系統(tǒng)分析大鼠心肌組織的膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。隨機(jī)精選出10個無血管的視野并觀察其膠原面積(血管周圍膠原面積避免計算在內(nèi))，各測量數(shù)據(jù)由計算機(jī)自動統(tǒng)計得出，CVF=視野內(nèi)心肌膠原面積/視野總面積，最后取平均值。

2.3.2 Real-time PCR法檢測PTEN mRNA表達(dá) 取大鼠左心室心尖部分適量，Trizol法提取大鼠心臟組織總RNA，行RNA瓊脂糖凝膠電泳。取2 μg以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，42℃孵育15 min，85℃孵育5 min冰上冷卻。以各檢測基因引物(引物序列如下)進(jìn)行實時定量PCR。定量PCR擴(kuò)增條件，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。收集每循環(huán)第3個步驟熒光信號量，以2-ΔΔCt反映各樣品相對于對照組樣品目的基因的表達(dá)水平，-ΔΔCt=對照組ΔCt-各樣品ΔCt，△Ct=目的△Ct-內(nèi)參△Ct。每個樣本重復(fù)3次然后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

在NCBI上搜索PTEN基因的序列，primer5軟件設(shè)計引物，由上海生工合成。

表1 引物序列表

2.3.3 Western blot 檢測心肌組織PTEN、AKT、P-AKT、MMP-2蛋白質(zhì)表達(dá) 剪取0.25 g左心室心尖組織加入200ulRIPA裂解液蛋白裂解，4℃ 12000rpm離心15 min，取上清分裝離心管中；按照BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)使用說明操作，測定蛋白濃度。然后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育，用1×TBST將一抗按照一定比例稀釋，PTEN(Rabbit，1∶1000)、AKT(Rabbit，1∶1000)、P-AKT(Rabbit，1∶1000)、MMP-2(Rabbit，1∶200)，actin(Mouse，1∶4000)，將膜與一抗一起孵育，4℃過夜。孵育結(jié)束，1×TBST洗3次，每次15 min。，然后二抗孵育用1×TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗(Proteintech)，稀釋比例鼠抗(M)1∶4000，兔抗(R)1∶6000，將稀釋后的二抗與膜共同孵育45～60 min。孵育結(jié)束，1×TBST洗3次，每次15 min。最后顯色、曝光，使用ECL化學(xué)發(fā)光液(Thermo)與膜孵育3 min，用吸水紙吸盡液體，用保鮮膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X膠片曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘，顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Masson染色及心肌膠原纖維容積比(CVF)

表2圖1顯示，顯微鏡(400×)下可見正常組大鼠心肌肌纖維呈紅色，胞核呈灰藍(lán)色或者灰黑色。模型組可見以藍(lán)、綠色膠原纖維呈網(wǎng)狀排列為主，中間夾雜極少量紅色肌纖維，CVF明顯增大(P<0.05)；心康低劑、中劑、高劑量組及芪藶強(qiáng)心組藍(lán)、綠色膠原纖維組織較模型組相對較少，CVF顯著下降(P<0.05)；心康低劑、中劑、高劑量組與芪藶強(qiáng)心組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；心康低、中、高劑量組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠CVF及PTEN mRNA表達(dá)比較

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與對照組比較：▲P<0.05；與心康低劑量組比較：▼P<0.05；與心康中劑量組比較：#P<0.05(CVF：膠原纖維容積比值；PTEN：人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因)

正常組；模型組；心康低劑組；心康中劑組；心康高劑組；對照組圖1 MASSON 染色(取材左心室橫切面，400×光鏡)

3.2 各組PTEN mRNA表達(dá)差異比較

表2顯示，與正常組比較，模型組大鼠PTENmRNA表達(dá)下降(P<0.05)；與模型組比較，心康低、中、高3組PTENmRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與對照組比較，心康沖劑高劑量組基因表達(dá)增多明顯(P<0.05)，心康沖劑低、中劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 各組大鼠PTEN、AkT、p-AkT、MMP-2蛋白表達(dá)差異比較

表3顯示，與正常組比較，模型組PTEN蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，AkT、p-AkT、MMP-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組比較，心康低、中、高劑量組及對照組PTEN蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，AkT、p-AkT、MMP-2蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)；與對照組比較，僅心康高劑組PTEN表達(dá)減少而MMP-2升高(P<0.05)，余心康低、中劑量組各蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與心康低劑量組比較，心康中劑量組各蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，僅心康高劑組PTEN表達(dá)減少而MMP-2升高(P<0.05)；與心康中劑量組比較，心康高劑組PTEN表達(dá)減少而MMP-2升高(P<0.05)。

表3 各組大鼠PTEN、AkT、p-AkT、MMP-2蛋白表達(dá)比較

注：PTEN：人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因；AkT：總蛋白激酶B；p-AkT：磷酸化蛋白激酶B；MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶-2；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與對照組比較：▲P<0.05；與心康低劑量組比較：▼P<0.05；與心康中劑量組比較：#P<0.05

圖2 PTEN、AkT、p-AkT、MMP-2蛋白質(zhì)電泳圖

4 討論

臨床上中藥治療慢性心衰療效突出。慢性心衰在古代文獻(xiàn)中尚無相關(guān)病名，而是根據(jù)癥狀將其類屬于古醫(yī)籍“水腫”“喘證”“心悸”范疇?，F(xiàn)代臨床醫(yī)家普遍認(rèn)為慢性心衰的病因病機(jī)是心腎陽氣虛為本，血瘀、水飲、痰濁為標(biāo)[8-9]。芪藶強(qiáng)心膠囊由葶藶子、黃芪、桂枝、人參、紅花、丹參、附子、玉竹、澤瀉、香加皮、陳皮組成，具有活血通絡(luò)、益氣溫陽、利水消腫作用，是目前臨床公認(rèn)的治療頑固性心衰的有效藥物，被2014年《JAcc》主編A NDeMaria教授評為2013年度亮點[10]。

心康沖劑以真武湯、升陷湯及參苓白術(shù)散為基礎(chǔ)方，具有“大補(bǔ)宗氣、溫補(bǔ)腎陽、健脾滲濕、溫陽化氣”[11]功效。方中白參、黃芪為君，升補(bǔ)宗氣；茯苓、薏苡仁為臣，健脾利水；生姜皮、大腹皮利肌膚之水；砂仁化濕運脾；陳皮理氣；制附片溫陽化飲；桂枝溫陽化氣為佐；柴胡、升麻提升清陽之氣；桔梗為舟揖之藥，載諸藥上達(dá)而至病所為使，共奏“升補(bǔ)宗氣、溫陽利水”之功。

PTEN具有磷脂和蛋白質(zhì)的雙重磷脂酶活性[12]，AkT稱蛋白激酶B，其羧基端的調(diào)節(jié)域含有磷酸化位點Ser473，AkT完全活化需要該位點的磷酸化[13]，即p-AkT是AKT活化的功能形式，被激活后發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、生長、增殖及凋亡等作用[14]?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)多由平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、哺乳動物的心肌細(xì)胞分泌，可能參與細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，與動脈硬化、結(jié)締組織病及臟器的纖維化等[15]有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[16]，MMPs表達(dá)增高常伴有組織纖維化，心力衰竭患者的MMP活性增強(qiáng)，且與進(jìn)行性的左心室增大有關(guān)。PTEN蛋白通過脂質(zhì)磷酸酶活性去磷酸化二磷酸肌醇和三磷酸肌醇從而負(fù)性調(diào)節(jié)AkT，成纖維細(xì)胞過表達(dá)PTEN的mRNA和蛋白能抑制AkT及其下游的基因MMPs[17]，使膠原基因轉(zhuǎn)錄和合成受阻。相反如果PTEN基因缺失或減少則會激活A(yù)kT，促使心臟成纖維細(xì)胞分裂增值加速，導(dǎo)致心肌纖維化。因此，PTEN是AkT/MMPs的“分子開關(guān)”[18]，在成纖維細(xì)胞的生長增殖與降解過程中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

本實驗中，Masson染色示阿霉素腹腔注射后心衰大鼠纖維化心肌，表現(xiàn)在心肌切片可見膠原纖維呈網(wǎng)狀排列，同時PTENmRNA及蛋白表達(dá)下降及AkT、p-AkT、MMP-2蛋白質(zhì)表達(dá)升高，再次證明心肌纖維化病理過程具有PTEN表達(dá)下降及AkT、p-AkT、MMP-2表達(dá)升高的特征。心康沖劑低劑量、中劑量、高劑量能減輕心肌纖維化，上調(diào)PTEN表達(dá)，下調(diào)AkT、p-AkT、MMP-2表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用，心康沖劑這種抗心肌纖維化作用與芪藶強(qiáng)心膠囊相當(dāng)。然而心康沖劑低、中、高劑量各組在調(diào)節(jié)PTEN/AkT/MMP-2分子上并未出現(xiàn)劑量-效應(yīng)遞增關(guān)系，分析其原因是否存在相關(guān)藥物受體耗竭的可能，尚未可知。且心康沖劑高劑量組MMP蛋白質(zhì)表達(dá)均較心康沖劑低、中劑量組明顯升高，而PTEN蛋白質(zhì)表達(dá)較之明顯下調(diào)，說明心康沖劑低、中、高劑量在抗心肌纖維化及干預(yù)PTEN/AkT/MMP-2分子作用中存在劑量差異性。從整體功效看，心康低、中劑量在調(diào)節(jié)PTEN/AkT/MMP-2各分子表達(dá)上更有優(yōu)勢。臨床應(yīng)用中藥治療慢性心衰既可以提高臨床療效，也可減輕西藥的副作用。本實驗證明，心康沖劑具有抗心衰心肌纖維化的作用，可為中藥新藥開發(fā)提供一定的依據(jù)。