李婕張鵬李小寧

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院檢驗科,安徽蕪湖241001)

1 NGS技術平臺

在現(xiàn)代生命科技手段中,涉及分子檢測的主要方法有：聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction,PCR)、Sanger測序即一代測序、高通量測序(next generation sequencing,NGS)、單分子測序即三代測序等。其中,一代測序技術開始于1977年,Sanger法只能對已知區(qū)域的單個或多個位點進行檢測,通量低,精度高;三代測序雖然能達到高通量,但需要投入的成本高,產(chǎn)出錯誤率高;而二代測序法即NGS具有目前除三代測序以外其他分子測序技術不能達到的通量高和成本低、精確度高且信息量豐富等特點,可以一次性檢測全外顯子和全基因組區(qū)域的所有位點,目前分子診斷測序領域應用最多的技術仍然是NGS。近十幾年間,它促進了基因組學科的飛速發(fā)展,其特點是合成與測序同時進行,通過定位辨識新合成的DNA或RNA片段末端的熒光標記來確定待測定序列。自2004年第1臺應用焦磷酸測序方法的NGS儀投入使用后,多種技術平臺相繼出現(xiàn)。例如,Illumina公司在2年后推出了Solexa測序平臺;2007年美國應用生物系統(tǒng)公司推出了以4色熒光標記寡核苷酸的連接合成為基礎,使得測序準確性得以提高的SOLiD測序平臺;2010年,半導體測序平臺和第三代單分子實時 (single molecule realtime,SMRT)DNA測序平臺正式走進部分實驗室[1]。但是每一種測序平臺在讀序長度、精準性、測序通量、成本消耗等多個方面具有一定的差異。Solexa測序系統(tǒng),測序平均讀長50 bp,全基因組覆蓋率大于95%,錯誤率低于十萬分之一;SOLiD測序平臺每次運行可以產(chǎn)生4 Gb的數(shù)據(jù),可實現(xiàn)大規(guī)模擴增和高通量并行測序;半導體及SMRT測序平臺則簡化了工作流程,縮短工作時間,缺點在于測序成本和錯誤率都相對較高[2-3]。新一代NGS攬括主全基因組測序(whole-genome sequencing,WGS)、全外顯子組測序 (whole-exome sequencing,WES)以及靶向目標測序 (targeted region sequencing,TRS)[4-5],根據(jù)需求,既可以選擇多個樣品的淺層掃描,也可以對復雜難以獲取的少量樣本進行深度測序。NGS技術在臨床分子診斷和治療方面具有兩大導向：(1)設計芯片,直接對已知的致病基因進行靶向基因組測序;(2)根據(jù)未知病因的疾病對外顯子組或全基因組進行測序,然后對得到的遺傳信息進行有效地解讀。NGS測序工作流程主要分為測序前文庫制備,樣本上機,測序后數(shù)據(jù)分析三個步驟,其中數(shù)據(jù)分析流程主要包含堿基識別,序列比對,識別序列變異,變異注釋這四個方面。另外,二代高通量測序既可以在較短時間內(nèi)對目的基因做到準確定位,對未知序列進行檢測,也可以對某組織在某一時間表達的mRNA進行測序[6]。因此,在相同條件下進行綜合比較,NGS具有不可替代的優(yōu)勢。

2 NGS臨床應用現(xiàn)狀

2.1 現(xiàn)階段,NGS在臨床腫瘤學的研究中呈現(xiàn)出巨大的檢測應用價值,在臨床分子診斷方面涉及到的DNA或者RNA測序在最廣泛的是針對腫瘤細胞來源進行的診斷與治療。腫瘤細胞具有異質(zhì)性和低頻突變的特點。癌癥基因組圖譜的制定和國際癌癥基因組計劃等大量繁瑣關鍵的工作內(nèi)容就是通過全基因組和外顯子測序完成的。一方面,NGS可以用于腫瘤基因的突變篩查,指導癌癥相關疾病的一級預防工作;另一方面,在治療上,通過NGS發(fā)現(xiàn)癌癥關聯(lián)基因,從中探索敲定新的治療靶點,用于個性化的用藥依據(jù)和監(jiān)測腫瘤預后情況。據(jù)報道,利亞德基因公司利用二代基因測序平臺關于突變位點開發(fā)了相關基因芯片,目的是結(jié)合腫瘤病人家譜遺傳信息,針對消化道和腹腔的8種癌型進行風險評估[7]。無獨有偶,llumina公司針對肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌關聯(lián)的26個基因突變位點,設計開發(fā)了名稱為 “Tru Sight Tumor panel”芯片,用于癌癥的靶向治療[8]。除了在腫瘤學研究進展中備受青睞,NGS也被廣泛應用于腎病[9]、糖尿病[10]、心血管疾病[11]等其他復雜疾病的臨床診斷和治療中。

2.2 轉(zhuǎn)座子 (Transposon)幾乎存在于所有的真核生物中,并在基因組中占有較大比例,是基因組中一段可以從原位上單獨復制或斷裂下來,經(jīng)過自身環(huán)化,然后插入到另一基因位置,能夠?qū)ζ浜蟮幕蚱鸬秸{(diào)控作用的NDA分子片段。在臨床相關診斷學實驗室,高通量測序技術不乏在轉(zhuǎn)座子研究中起到重要作用,例如測定計算轉(zhuǎn)座子含量、分析多體性分布規(guī)律、鑒定罕見類型轉(zhuǎn)座子等。利用高通量測序數(shù)據(jù)獲得的轉(zhuǎn)座子含量的信息,可以更加全面加深對DNA、RNA進行更加深刻詳盡的剖析和認識。

2.3 在遺傳性疾病的檢測方面,NGS以其更加成熟的技術、更加低廉的費用、更短的實驗周期,為此提供了更加優(yōu)質(zhì)的選擇。2015年初,國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準了NGS在臨床4個方面的試點,包括遺傳病診斷、產(chǎn)前篩查與診斷、植入前胚胎遺傳學診斷。有實驗表明,高通量測序技術通過對孕婦血漿進行STR分型,使得無創(chuàng)產(chǎn)前親子鑒定存在可能[12]。此外,面對疑難罕見疾病診療難的窘境,全基因組測序引發(fā)了新的思路。例如對于染色體微陣列基因芯片可以用于兒童染色體病、基因組病、單基因病的診斷和治療。CNV-sep在無創(chuàng)產(chǎn)前基因組病檢測方面的應用將進一步降低智力障礙或者多發(fā)畸形等患兒的出生率,從而減少家庭和社會負擔,保證理療資源更合理高效配置。

2.4 人體最龐大、最復雜的系統(tǒng)為細菌、真菌、病毒等微生物構(gòu)成的胃腸道系統(tǒng),在臨床微生物病原學檢測方面,檢驗醫(yī)學微生物學實驗室已經(jīng)開始將高通量測序用于對微生物的深入研究,并嘗試對細菌、病毒等微生物進行全貌描述。近年來,分子生物學技術得到快速發(fā)展,特別是以高通量測序為代表的宏基因組學技術的突破,為病原微生物研究開拓了新的思考途徑,并提供了新的考究方法和解決難題的手段,特別用于腸道、口腔、糞便、新生母嬰微生物高通量宏基因組菌群分類以及在傳染病溯源、預測中的作用。16S rRNA克隆文庫技術是應用最為廣泛的菌種鑒定技術之一,它可以提供許多無法培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的微生物的信息,如復雜的糞便標本,NGS都能做到準確度高,通過全基因組測序分析,從而確定微生物種群優(yōu)勢菌的具體種屬信息。由此可見,未來關于微生物群落與疾病的研究方面,一定能夠取得既獨特又新穎的見解和突破。

3 NGS的展望

不僅僅在醫(yī)學,高通量測序技術目前被廣泛地應用于生物學研究的多個領域,自熱環(huán)境檢測、畜牧養(yǎng)殖業(yè)微生物研究、食品和工業(yè)領域等。NGS技術使眾多學者們對各生物研究對象的研究發(fā)生了從量到質(zhì)的革新,拓寬了對遺傳信息研究的廣度和深度。NGS開啟了基因探索和學習的新時代,它的應用不斷拓寬和提高了人類對物質(zhì)微小分子水平的根透徹認識,尤其是臨床醫(yī)師面對病因不明、機制機理復雜的遺傳性疾病。NGS技術的誕生促使臨床分子水平基因診斷從單基因時代跨越到多基因時代,具有劃時代意義,是測序技術發(fā)展歷程中的一個里程碑。另一方面,隨著高通量測序技術而涌現(xiàn)的小RNAs測序、降解組測序、DNA甲基化測序等新方法為眾研究人員進行分子生物學相關探究提供了更多便捷的選擇。但是目前NGS技術仍然處于起步階段,對臨床診斷醫(yī)學乃至于各個領域應用還不夠完全滲透,國際測序技術的臨床應用標準還有待加強完善補充。由于高通量測序技術產(chǎn)生的序列片段冗長,數(shù)據(jù)含量信息巨大,因此對數(shù)據(jù)分析增加了難度,對基因組中重復序列的研究也提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。由于現(xiàn)行算法可能存在有灰區(qū)、假陽性率高等缺陷,所以需要開發(fā)復雜的算法以為臨床提高更精準的結(jié)果。如果臨床實驗室能夠在有效處理分析高通量數(shù)據(jù)的同時,還能挖掘出更有效的信息以適用于臨床診斷,那么高通量技術必將引領臨床醫(yī)學邁向更高一個階梯?？偠灾?NGS技術給基因組學研究帶來了一個嶄新的發(fā)展機遇,將更加深入臨床實踐,守護生命傳承。