李秋芳

[摘要]目的為了解米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的毒性，探討使用米非司酮后子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡情況以及促血管生成因子水平變化情況。方法取培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞，觀察不同濃度米非司酮的細(xì)胞毒性情況，以染色流式細(xì)胞術(shù)檢查細(xì)胞凋亡的全科，同時(shí)使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)觀察米非司酮對(duì)促血管生成因子水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度上升，細(xì)胞死亡率增加、細(xì)胞解體、排列紊亂現(xiàn)象嚴(yán)重；米非司酮對(duì)基因pro-Caspase3表達(dá)有抑制作用，藥物對(duì)Ang-1表達(dá)有抑制效果，對(duì)VEGF、Ang-2表達(dá)有促進(jìn)效果。結(jié)論米非司酮可能通過(guò)調(diào)控pro-Caspase3表達(dá)促進(jìn)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡有效果，同時(shí)此藥抑制機(jī)體Ang-1表達(dá)、增加VEGF、Ang-2表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜；促血管生成因子；米非司酮；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)]R711.52 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2095-0616（2017）17-33-04

米非司酮是臨床圍絕經(jīng)期功血常用治療藥物，功血發(fā)病與神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)功能失調(diào)有關(guān)，而米非司酮能增加機(jī)體內(nèi)孕酮水平、抑制子宮內(nèi)膜增生，從而有效控制出血，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)若連續(xù)用藥3個(gè)月以上，易造成閉經(jīng)情況。有學(xué)者認(rèn)為造成閉經(jīng)現(xiàn)象發(fā)生與米非司酮促細(xì)胞凋亡有關(guān)，但目前臨床對(duì)這方面研究較少，故本文觀察米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡、促血管生成因子表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

實(shí)驗(yàn)試劑：實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（Takara）、Caspase3抗體（Cell Signaling）、米非司酮（Sigma），DMEM/F12培養(yǎng)基，人子宮內(nèi)膜細(xì)胞（中科院實(shí)驗(yàn)室）。

細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞放于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，后將培養(yǎng)基置于保溫箱中培養(yǎng)，條件設(shè)置為溫度37℃、飽和濕度、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%，以不同濃度（5、10、15μg/mL）米非司酮對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，在細(xì)胞培養(yǎng)48h后用電學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 將經(jīng)15μg/mL米非司酮處理的子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)2d后，使用realtime-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)促血管生成因子VEGF、Ang-2、Ang-1表達(dá)量，本次檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解并提取RNA，后將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后使用PCR儀對(duì)PCR擴(kuò)增，參數(shù)為94℃2min，94℃20s，50℃-60℃20s，60℃40s，如此重復(fù)40次，讀取Ct值，計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量，檢測(cè)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將細(xì)胞以不同濃度米非司酮藥物進(jìn)行處理，后經(jīng)消化、離心以流式細(xì)胞儀以及試劑盒（AnnexinV-FITC/PI），檢測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡情況，判斷標(biāo)準(zhǔn)：早期凋亡結(jié)果為Annexin V⁺/PI一，晚期死亡為Annexin V⁺/PI⁺，總凋亡率為兩種凋亡率之和。 1.2.3細(xì)胞凋亡基因Caspase3蛋白表達(dá)檢測(cè) 以15μg/mL米非司酮處理細(xì)胞，并培養(yǎng)2d，后裂解取細(xì)胞蛋白，為計(jì)算蛋白濃度使用BCA法，繪制稀釋后蛋白濃度曲線，以10%聚丙烯酰胺凝膠對(duì)等量蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。加入封閉液封閉2h環(huán)境條件為室溫，2h后加入兔抗人β-actin稀釋液、一抗Caspase3稀釋液，在4℃溫度下孵育過(guò)夜。用PBST沖洗3次，后加入有HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗稀釋液（按1：7500），室溫孵育1小時(shí)，再以PBST洗3次，加入電化學(xué)發(fā)光底物，使用成像儀拍照，本次使用的PBST為PBS溶液加上Tween-20。

1.3觀察指標(biāo)

觀察不同濃度米非司酮刺激下子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及凋亡情況，同時(shí)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)促血管生成因子水平變化的影響，同時(shí)觀察細(xì)胞凋亡因子pro-Caspase3以米非司酮處理后表達(dá)情況。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞在以不同濃度米非司酮刺激后生長(zhǎng)情況

藥物劑量越大細(xì)胞解體、排列紊亂現(xiàn)象越嚴(yán)重，見(jiàn)圖1。

2.2藥物對(duì)細(xì)胞凋亡基因pro-Caspase3表達(dá)的影響

米非司酮對(duì)基因pro-Caspase3表達(dá)有抑制作用，見(jiàn)圖2。

2.3子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡與不同濃度藥物的相關(guān)性

對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.27±0.35）%，經(jīng)5、10、15μg/mL米非司酮處理后，細(xì)胞凋亡率分別為（10.42±0.84）%、（12.67±1.32）%、（18.75±1.53）%，結(jié)果表明藥物濃度約大細(xì)胞凋亡率越高，見(jiàn)圖3。

2.4米非司酮對(duì)促血管生成因子表達(dá)的影響

藥物對(duì)Ang-1表達(dá)有抑制效果，對(duì)VEGF、Ang-2表達(dá)有促進(jìn)效果，見(jiàn)圖4。

3討論

米非司酮是臨床強(qiáng)效抗孕激素的藥物，多用于催經(jīng)止孕、功血、抗早孕、死胎引產(chǎn)以及宮內(nèi)節(jié)育器取出、刮宮術(shù)等治療中，其不僅能抑制子宮內(nèi)膜增生、分化，還對(duì)內(nèi)膜退化、凋亡有促進(jìn)作用，同時(shí)對(duì)絨毛、蛻膜組織有破壞效果，能降低機(jī)體血孕酮水平，使黃體萎縮、前列腺素釋放。但目前臨床對(duì)藥物治療作用機(jī)制尚未完全了解，本次通過(guò)觀察內(nèi)膜細(xì)胞經(jīng)米非司酮刺激后生長(zhǎng)、凋亡情況以及相關(guān)因子水平表達(dá)情況，來(lái)分析藥物作用。

本次觀察不同濃度藥物處理后細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡情況，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度上升，細(xì)胞死亡率增加。有研究表明子宮內(nèi)膜增生與子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，細(xì)胞凋亡不足會(huì)使細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致增生，子宮內(nèi)膜過(guò)度增生會(huì)引發(fā)圍絕經(jīng)期子宮出血，而過(guò)度凋亡則會(huì)引發(fā)萎縮癥，本次研究顯示米非司酮藥物濃度增加有促細(xì)胞凋亡效果，提示此藥可能通過(guò)加速內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，從而產(chǎn)生抑制內(nèi)膜增生作用，進(jìn)而達(dá)到治療目的。同時(shí)在藥物處理細(xì)胞48h后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜細(xì)胞數(shù)量減少且細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改變。結(jié)果提示米非司酮對(duì)細(xì)胞毒性與給藥時(shí)間長(zhǎng)短、用藥劑量多少有關(guān)，大劑量使用藥物會(huì)造成細(xì)胞出現(xiàn)解體、排列紊亂等情況，因此臨床在用藥時(shí)為避免毒性增強(qiáng)，需要避免長(zhǎng)時(shí)間、大劑量用藥。Ang-1、Ang-2為血管生成調(diào)節(jié)因子，其中前者能與內(nèi)皮細(xì)胞中Tie-2受體結(jié)合，使受體磷酸化，從而產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的效果，而后者能抑制前者功能，使血管重構(gòu)，VEGF能與Ang-2產(chǎn)生協(xié)同作用促進(jìn)新血管生成。本次研究結(jié)果顯示使用藥物后Ang-1表達(dá)降低、VEGF、Ang-2水平上升，結(jié)果提示米非司酮通過(guò)提高內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF、Ang-2水平，從而促進(jìn)血管生成，改善患者功血癥狀。同時(shí)本次研究發(fā)現(xiàn)15μg/mL米非司酮處理細(xì)胞后48h，pro-Caspase3表達(dá)量明顯較對(duì)照組降低，Caspase3為執(zhí)行細(xì)胞凋亡的效應(yīng)蛋白，有研究表面pro-Caspase3表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)性，本次研究結(jié)果提示米非司酮可能通過(guò)調(diào)控pro-Caspase3表達(dá)，來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以抑制子宮內(nèi)膜增生，改善患者功血情況。

綜上所述，米非司酮對(duì)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡有促進(jìn)效果，其可能通過(guò)調(diào)控pro-Caspase3表達(dá)，達(dá)到促細(xì)胞凋亡的目的，同時(shí)此藥抑制機(jī)體Ang-1表達(dá)、增加VEGF、Ang-2表達(dá)，能促進(jìn)血管生成。

（收稿日期：2017-05-09）