劉 元，李守婷，申進(jìn)文，文春南，文 晴，阮 元，麻兵繼*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) a中藥材系，b生物系，河南 鄭州 450002)

懷山藥(DioscoreaoppositaThunb)為“四大懷藥”之一，是河南著名的道地藥材，具有健脾益胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精等功效[1]。目前，對懷山藥的研究多集中在栽培技術(shù)、化學(xué)成分和藥理研究等方面[2-3]，而關(guān)于懷山藥與其內(nèi)生真菌的關(guān)系方面的研究則較少。本課題組前期對懷山藥道地產(chǎn)區(qū)——河南焦作溫縣一帶的懷山藥根中內(nèi)生真菌進(jìn)行了初步分離純化研究，并對其中一株內(nèi)生真菌厚孢鐮刀菌進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，結(jié)果表明懷山藥內(nèi)生真菌能產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物[4]。雖然中藥材內(nèi)生菌和藥材質(zhì)量之間存在密切聯(lián)系，相關(guān)研究文獻(xiàn)也較多[5-6]，但有關(guān)懷山藥內(nèi)生真菌與藥材品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，在整體水平上對懷山藥植株內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，有利于進(jìn)一步闡明內(nèi)生真菌與懷山藥道地性的關(guān)聯(lián)，從而為更好地開發(fā)利用懷山藥優(yōu)良品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。另外，傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要依照真菌的形態(tài)、生長以及生理生化等特征進(jìn)行研究。然而真菌的種類繁多，個(gè)體差異性不明顯，且其生長、生理生化特征也會隨著環(huán)境的變化而發(fā)生改變。因此，采用傳統(tǒng)方法對中藥材內(nèi)生真菌進(jìn)行正確的分離純化、分類鑒定均存在較大的困難。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸序列分析已被廣泛的應(yīng)用于真菌分類鑒定中，目前常用的分子標(biāo)記為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)，可根據(jù)ITS序列將真菌歸類到種或亞種水平[7]。

高通量測序技術(shù)(high throughput sequencing，HTS)具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低運(yùn)行成本的特點(diǎn)，該測序技術(shù)已被應(yīng)用于多種生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性研究[8]。高通量測序可以深入、細(xì)致地研究微生物群落結(jié)構(gòu)，從而克服由于傳統(tǒng)菌株分離培養(yǎng)的限制而導(dǎo)致很難獲得宿主植物完整內(nèi)生真菌譜的技術(shù)障礙，近年來已應(yīng)用于多個(gè)中藥材道地性的研究[9-10]。GSS高通量測序(green shield sequencing，GSS)是基于目前最常用的Illumina高通量測序技術(shù)上最新改進(jìn)的一種測序技術(shù)，采用了液滴PCR技術(shù)。與普通的Illumina高通量測序技術(shù)相比，GSS高通量測序可以從源頭上消除宿主植物樣本中葉綠體和線粒體序列帶來的干擾，還原樣本中微生物群體的真實(shí)比例。本次測序合作單位北京艾普希隆生物科技有限公司的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，運(yùn)用該方法所測定的真菌測序量占樣本總測序量的比例最高可升至 99.7%(水稻葉片)，這為建立完整、可靠、穩(wěn)定和準(zhǔn)確的懷山藥道地藥材內(nèi)生真菌標(biāo)準(zhǔn)的譜圖庫提供了技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016年10月于河南焦作溫縣懷山藥道地產(chǎn)區(qū)采集10株無明顯病害的懷山藥，分別隨機(jī)取根部和莖部，均勻混合后放入無菌樣品袋中，低溫保鮮，于24 h內(nèi)進(jìn)行表面消毒處理。

1.2 表面滅菌

將懷山藥根、莖用無菌水沖洗干凈，再用75%乙醇浸泡1～2 min，3%次氯酸鈉浸泡2～3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分。表面消毒效果檢驗(yàn)參照文獻(xiàn)[11]中的方法。

1.3 樣本DNA提取與純化

使用環(huán)境樣本DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

1.4 ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增

以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶有Barcode的特異引物ITS3(5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對樣本的ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，每個(gè)PCR反應(yīng)終止于線性擴(kuò)增期，PCR結(jié)束后將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用OMEGA膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。送北京艾普希隆生物科技有限公司對真菌的ITS區(qū)進(jìn)行Paired-end測序，測序使用Illumina(MiSeq)平臺。

1.5 生物信息學(xué)分析

雙端測序得到的PE reads使用FLASH進(jìn)行拼接，同時(shí)對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列等操作過程結(jié)束后完成數(shù)據(jù)過濾，得到可供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標(biāo)序列。在97%的相似性水平上使用UPARS算法進(jìn)行OTU的聚類，統(tǒng)計(jì)樣品每個(gè)OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。

1.6 多樣性分析

在群落生態(tài)學(xué)的研究中，物種多樣性包括Alpha多樣性(群落內(nèi))和Beta多樣性(群落間)。其中Alpha多樣性是指群落內(nèi)或棲息地內(nèi)的物種多樣性，通過樣本的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐度、均勻性及多樣性等信息。Alpha多樣性分析包括一系列生態(tài)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)，如計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(phylogenetic diversity，PD)等進(jìn)行生物多樣性分析[11]。豐富度指數(shù)(Chao1)和Shannon、Simpson、PD的計(jì)算用Mothur1.30.1軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷山藥根莖和莖中內(nèi)生真菌物種組成

物種組成分析反映樣品在不同分類學(xué)水平上的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)。圖1中A和B分別展示了懷山藥內(nèi)生真菌在門(phylum)水平和綱(class)水平的群落結(jié)構(gòu)和分類比較結(jié)果。從門水平來看，懷山藥根和莖中內(nèi)生真菌主要分布在子囊菌門(Ascomycota)，僅有少量分布于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。從綱分類水平來看，其內(nèi)生真菌主要分布在座囊菌綱(Dothideomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)中，少量分布在傘菌綱(Agaricomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)中。懷山藥根和莖中真菌菌群分布有差異，其中莖中子囊菌門占真菌菌群的92.0%，而根中子囊菌門約占真菌菌群的97.4%。另外，盤菌綱(Pezizomycetes)真菌在莖中存在而根中沒有，而酵母菌(Saccharomycetes)為根中特有菌。

選取豐度最高的50個(gè)操作單元(OTUs)與NCBI數(shù)據(jù)庫中基因序列進(jìn)行Blast比對，相似物種(相似度在97%以上)及GenBank登錄號如圖2所示。進(jìn)化樹將豐度最高的50個(gè)OTUs進(jìn)行展示，其中Hannaellasp.(KY305135)為懷山藥根中特有，豐度值為102；Hannaellasp.(KT962991)、Acremoniumsp.(KY988552)、Aspergillussp.(KY407901)為懷山藥莖中特有，其豐度值分別為65、89和56；Rhodosporidiumsp.(KF690377)、Ceratobasidiumsp.(KX953590)、Ochroconisconstricta(KX610329)、Fusariumsp.(KY950388)、Botryotiniafuckeliana(KX096661)、Passalorasp.(JX507956)為根和莖共有，但根中豐度值明顯高于莖；Hannaellasp.(KX758406)、Hannaellasp.(KX758405)、Derxomycessp.(KY588901)、Bulleraunica(KY101799)、Rhodotorulasp.(KY033113)和Glomerellacingulata(AB696727)為根和莖共有，但莖中豐度值明顯高于根。

圖1 懷山藥根、莖樣品中內(nèi)生真菌群落分布

圖2 種水平內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 懷山藥根和莖中內(nèi)生真菌生物多樣性

2.2.1 單個(gè)樣品復(fù)雜性

根和莖的Alpha多樣性分析的Shannon指數(shù)、Chao 1指數(shù)、PD和物種數(shù)4個(gè)指數(shù)見圖3所示。豐富度以Chao 1表示，多樣性以Shannon 指數(shù)表示，檢測到的物種的數(shù)量以O(shè)bserved表示，系統(tǒng)發(fā)育譜系多樣性以PD表示，結(jié)果均為莖大于根。綜合各項(xiàng)指標(biāo)顯示，懷山藥根中的物種豐富度和多樣性等均略低于莖。

圖3 樣品的Alpha 多樣性

2.2.2 稀釋曲線

稀釋曲線表明每個(gè)樣品物種的豐富度，用來反映測序情況。分別使用觀測到的物種數(shù)(Observed)、Chao 1及Shannon指數(shù)進(jìn)行稀釋曲線的制作。如圖4所示,對不同的樣本分別進(jìn)行分析，顏色代表不同樣本，橫坐標(biāo)代表重抽樣抽出的序列數(shù)，縱坐標(biāo)代表不同的多樣性值。從稀釋曲線來看，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨向平緩但未進(jìn)入平臺期，說明測序數(shù)據(jù)合理，基本覆蓋樣品中所有種群，即使再增加測序數(shù)量也只會產(chǎn)生少量新的OTUs。

圖4 懷山藥根、莖樣品的稀釋曲線

2.2.3 Rank abundance 曲線

Rank abundance曲線可以解釋多樣性的兩個(gè)方面，即物種豐度和物種均勻度。在水平方向，物種的豐度由曲線的寬度來反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀(平滑程度)反映了樣本中的物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。由圖5可知，樣品曲線斜率較大，表明懷山藥根和莖中均有優(yōu)勢菌，這也與圖1中的分析結(jié)果一致。從水平方向，兩個(gè)樣品在橫軸上跨度即分類豐富度基本相當(dāng)。

圖5 懷山藥根、莖樣品的Rank abundance曲線

熱度圖(Heatmap)用于表示一個(gè)或多個(gè)組的樣品在某一分類水平上的群落組成和豐度。豐度用顏色深淺來表征，方塊顏色越偏紅，說明該種的豐度越高，越偏藍(lán)色說明豐度越低?？筛鶕?jù)豐度和組成進(jìn)行聚類，也可按照特定的順序進(jìn)行橫縱坐標(biāo)的排列。由圖6可知，在種水平上，懷山藥根中豐度最高的為擔(dān)子菌門葡萄孢盤菌屬灰色霉菌(Botryotiniafuckeliana)，莖中豐度最高的為鏈格孢屬一個(gè)未知種的(Alternariasp.)。

圖6 種水平高豐度類群熱度

2.2.4 Venn圖

在OTU分析中，Venn用于表示多個(gè)組樣品的OTU共有和獨(dú)有物種情況。由圖7可知，根中特有的OTU為35個(gè)，莖中特有的OTU為75個(gè)，根和莖共有的OTU為233個(gè)。Venn圖在一定程度上反映出兩個(gè)樣品中內(nèi)生真菌群落組成的相似程度，表明根和莖中相同的種類占多數(shù)，且懷山藥莖中內(nèi)生真菌物種多樣性程度略高于根。

圖7 懷山藥根、莖樣品OTUs分布

3 討論

本研究首次將基于當(dāng)前Illumina MiSeq測序平臺的最新改進(jìn)技術(shù)GSS高通量測序技術(shù)應(yīng)用于懷山藥內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)多樣性研究，從基因組的水平上來解析微生物群落結(jié)構(gòu)，突破了很多厭氧內(nèi)生真菌不能被分離培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸[12]，既克服了傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法存在的通量低的缺陷，又從源頭上消除植物樣本中葉綠體和線粒體序列帶來的干擾，還原了懷山藥根和莖中內(nèi)生真菌群體的真實(shí)比例。

本研究結(jié)果表明，懷山藥根和莖樣品中內(nèi)生真菌物種組成豐富，但二者在種群結(jié)構(gòu)上有一定的差異。懷山藥根和莖中內(nèi)生真菌在門水平上均主要為子囊菌門Ascomycota(根97.3%，莖92%)，少量分布在擔(dān)子菌門Basidiomycota(根2.6%，莖7.7%)；這與王曉龍[13]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法研究的結(jié)果一致。在綱的水平上，主要分布有座囊菌綱Dothideomycetes(根34.1%，莖65.5%)，錘舌菌綱Leotiomycetes(根35.9%，莖8.1%)，糞殼菌綱Sordariomycetes(根22.2%，莖13.3%)；在目的水平上，主要分布于格孢腔菌目Pleosporales(根24.2%，莖60.2%)，蠟釘菌目Helotiales(根34.9%，莖7.6%)，糞殼菌目Sordariales(根20.1%，莖3.4%)；在屬的水平上，主要分布于鏈格孢屬Alternaria(根17.1%，莖33.2%)，葡萄孢盤菌屬Botryotinia(根34.1%，莖6.3%)，毛球殼屬Lasiosphaeriaceae(根20.0%，莖0.3%)；另外，GSS高通量測序結(jié)果還獲得了一部分的弱勢菌群，但由于弱勢菌群在整個(gè)物種組成中所占比例甚小，本論文未對其進(jìn)行一一列舉。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2004.

[2] 韓鎖義, 張新友, 王素霞, 等. 河南省懷山藥生產(chǎn)現(xiàn)狀[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 40(9): 109-111.

[3] 白冰, 李明靜, 王勇, 等. 懷山藥化學(xué)成分研究[J]. 中國中藥雜志, 2008, 33(11): 1272-1274.

[4] 王曉龍, 李守婷, 文春南, 等. 懷山藥內(nèi)生真菌厚孢鐮刀菌的次生代謝產(chǎn)物研究[J]. 中草藥, 2015, 46(7): 966-969.

[5] 江曙, 錢大瑋, 段金廒, 等. 植物內(nèi)生菌與道地藥材的相關(guān)性研究[J]. 中草藥, 2008, 39(8): 1268-1272.

[6] 范麗霞, 鄭繼平, 白新鵬. 藥用植物內(nèi)生菌及其對道地藥材影響的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(22): 11221-11223.

[7] LUO C, TSEMENTZI D, KYRPIDES N, et al. Direct comparisons of Illumina vs.Roche 454 sequencing technologies on the same microbial community DNA Sample[J]. Plos One, 2012, 7(2): e30087.

[8] MARGULIES M, EGHOLM M, AITMAN W E, et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J]. Nature, 2005, 437(7057): 376-380.

[9] 陳澤斌, 李冰, 王定康, 等. 鐵皮石斛葉片內(nèi)生真菌多樣性的研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 30(10): 978-983.

[10] 侯曉強(qiáng), 付亞娟, 袁建平, 等. 大花杓蘭內(nèi)生真菌多樣性研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 54(6): 1357-1360.

[11] 陳澤斌, 代方平, 寸林江, 等. 煙草內(nèi)生細(xì)菌分離方法的優(yōu)化研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào), 2014, 20(1): 90-95, 102.

[12] AMMANN R R, LUDWIG W, SCHLEIFFER K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews, 1995, 59(1): 143-169.

[13] 王曉龍. 懷山藥內(nèi)生菌的分離及其次生代謝產(chǎn)物的初步研究[D]. 鄭州: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.