楊諶

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

申邦

(農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢 430070；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種呈世界性分布的專性寄生于溫血動物的頂復(fù)門寄生原蟲。1908年,Nicolle和Manceaux首次在剛地梳祉鼠的肝脾單核細胞中發(fā)現(xiàn)了弓形蟲的無性生殖階段——速殖子,根據(jù)此蟲寄生的宿主名稱和速殖子的形態(tài),將其命名為“剛地弓形蟲”。弓形蟲專門寄生在有核細胞內(nèi),其中間宿主普遍而且無特異性,可以感染所有的哺乳動物,也包括人,引起人獸共患弓形蟲病。據(jù)統(tǒng)計,全世界大約有25%～50%的人感染弓形蟲,甚至在歐洲的一些地區(qū),弓形蟲的感染率達到80%[1]。因此，需要快速簡便的檢測方法用于該病的防控。

目前檢測弓形蟲病主要有病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法。病原學(xué)診斷方法主要有直接涂片或組織切片染色、動物接種分離弓形蟲病原。免疫學(xué)方法主要有染色試驗(Dye Test，TD)、間接血凝試驗(Indirect Hemagglutination Test，IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、間接熒光抗體試驗(Indirect Fluorescent Antibody Test,IFA)、親和素-生物素-酶聯(lián)免疫吸附試驗(Avidin Biotin Peroxidase Complex Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ABC ELISA)和免疫膠體金技術(shù)(Immune Colloidal Gold,ICG)等。分子生物學(xué)診斷方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)?？偟膩砜?目前診斷弓形蟲病的方法較多，這些傳統(tǒng)的病原診斷方法雖然操作簡單，但檢出率比較低，容易漏診。免疫學(xué)診斷方法目前主要的難題是如何區(qū)分新發(fā)感染和既往感染。PCR 技術(shù)以及在此基礎(chǔ)上衍生出的各種新檢測技術(shù),大大提高了對弓形蟲病檢測的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性,但仍存在基層推廣有一定局限性[2]。因此，急需一種既準(zhǔn)確又簡單的診斷弓形蟲病的方法。

研究表明，弓形蟲的多種蛋白均可刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。致密顆粒蛋白10(dense granule protein10,GRA10)是弓形蟲致密顆粒分泌的一種蛋白，它表達量高，而且其在弓形蟲緩殖子和速殖子時期均可表達。經(jīng)預(yù)測，GRA10具有較好的免疫原性，所以認為GRA10是潛在的特異好的弓形蟲病診斷標(biāo)識。

本研究擬構(gòu)建GRA10(AA 4-487)原核表達載體pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)，并對其進行誘導(dǎo)表達、純化與鑒定，為將重組GRA10(AA 4-487)蛋白用于弓形蟲病診斷試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DH5α克隆菌株、BL21(DE3)表達菌株、ME49型弓形蟲蟲株均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實驗室保存；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和小提質(zhì)粒試劑盒均購自北京全式金公司；同源重組試劑盒購自南京諾唯贊公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；His-Tag小鼠單克隆抗體購自美國Proteintech公司；Alexa488標(biāo)記羊抗鼠IgG購自美國Licor公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)ToxoDB中弓形蟲ME49蟲株的GRA10(AA 4-487)基因設(shè)計引物，上游引物:5’-ACCGCGAACAGATTGGAGGTCTGTACTACCGGCTGAGCA-3’；下游引物:5’-TCGAATTCGGATCCTCTAGTTCACTTTCGCGAGGGTAGCATGG-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 GRA10(AA 4-487)基因的PCR擴增

提取弓形蟲ME49株RNA然后制備弓形蟲cDNA。弓形蟲RNA的提取:將收集的蟲體離心，棄上清，加入1mL Trizol重懸，并反復(fù)吹打混勻后將樣品轉(zhuǎn)入1.5mL無RNase的離心管中，劇烈震蕩渦旋3min，使蟲體充分裂解，室溫放置10min；按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置2～3min；4℃12000r/min離心15min；小心吸取上層水相置于新的1.5mL無RNase的離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻后，置于室溫沉淀10min；4℃12000r/min離心10min，棄去上清，RNA將以白色沉淀的形式沉于管底；加入1mL用DEPC水配成的75%乙醇，翻轉(zhuǎn)離心管，洗滌沉淀；4℃7500r/min離心5min，盡量棄去上清，在超凈臺中風(fēng)干；加入30μL無 RNase DEPC水，溶解RNA沉淀；用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的總RNA質(zhì)量并通過紫外分光光度計測定總RNA濃度和純度。弓形蟲cDNA的制備:將0.1～0.5ng總RNA和1μL Oligo(dT)18混合，再加入無核酸酶的高純水補至12μL混合；在PCR儀中65℃反應(yīng)5min，冰上冷卻。取上述產(chǎn)物12μL，5×Reaction Buffer 4μL，RiboLockTMRNA 酶抑制劑1μL，10mmol/L dNTP Mix 2μL和RevertAidTMM-Mu LV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL混合，總體積20μL；在PCR儀中42℃ 60min，70℃ 5min，產(chǎn)物-20℃儲存。以最后產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，模板1μL，5×KD plus buffer 10μL，上下游引物各1μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，KD plus DNA聚合酶 1μL，滅菌水補至50μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s；58℃退火30s；68℃延伸1min40s；共35個循環(huán)；68℃延伸5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 GRA10(AA 4-487)基因擴增產(chǎn)物的回收

按照DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說明進行操作。

1.2.4 同源重組構(gòu)建質(zhì)粒

按照諾唯贊多片段克隆試劑盒說明進行操作。

1.2.5 重組GRA10(AA 4-487)的表達鑒定

將含有pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)質(zhì)粒的BL21(DE3)表達菌接種到LB中，于37℃以180r/min震蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液光密度D600nm值到達0.5左右時，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，于37℃以180r/min震蕩誘導(dǎo)3h。收集菌液于4℃6000r/min離心12min，棄去上清，用20mL的His-binding buffer重懸，再用高壓細胞破碎儀破碎。待菌液呈澄清半透明時取200μL在4℃以12000g離心10min，取上清40μL加入50μL 2×SDS上樣緩沖液和10μL DTT充分混合；將上清去除后用200μL ddH2O重懸包涵體，取40μL 加入50μL 2×SDS上樣緩沖液和10μL DTT充分混合；將上述2種樣品沸水煮10min，冰上冷卻5min然后進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測分析。

1.2.6 重組GRA10(AA 4-487)蛋白的純化

將表達后的菌液4℃ 6000r/min離心12min，棄上清；以1/10原培養(yǎng)基體積的緩沖液A重懸沉淀，再用高壓細胞破碎儀破碎3次；4℃12000r/min離心10min，棄上清；用PBS洗滌沉淀2～3次；往沉淀中加19.7mL緩沖液A、9.7μL 5mmol/L DTT和0.3mL 20%N-十二烷基肌氨酸鈉，劇烈攪拌使其溶解，室溫靜置30min2h；4℃12000r/min離心20min，取上清；加入終濃度為0.2%的PEG4000,1.0mmol/L氧化性谷胱甘肽和0.2mmol/L還原性谷胱甘肽，室溫靜置30min～2h；將上述樣品加入透析袋后用PBS透析3d，然后用蔗糖濃縮后-80℃保存。

1.2.7 重組GRA10(AA 4-487)蛋白的Western blot鑒定

將需要進行Western blot鑒定的凝膠轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡；取8張濾紙和一張硝酸纖維素膜(NC膜)，將8張濾紙浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液，將NC膜浸泡在甲醛溶液中30s后迅速用ddH2O洗5s再浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液；用濕電轉(zhuǎn)膜儀將目的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)到NC膜上。將NC膜放入小托盤中，加入封閉液(1%BSA或5%脫脂奶粉，溶于PBS)，平放在平緩搖動的搖床平臺上于室溫震搖2h；用PBS洗滌5次，每次5min。NC膜浸泡于1︰2000稀釋His-Tag的小鼠單克隆抗體的TBST溶液中，于室溫平緩震搖2h；用TBST洗滌5次；浸泡于1︰10000稀釋熒光羊抗鼠抗體的TBST溶液中，于室溫平緩震搖2h，注意避光；用TBST洗滌5次后用儀器拍照。

NC膜浸泡于1︰500稀釋感染弓形蟲小鼠的陽性血清的TBST溶液中，于室溫平緩震搖2h；用TBST洗滌5次；浸泡于1︰2000稀釋HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)的TBST溶液中，于室溫平緩震搖2h；用TBST洗滌5次后加顯色液用儀器拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因GRA10(AA 4-487)的擴增

1.GRA10(AA 4-487);M.Marker圖1 GRA10(AA 4-487)片段的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

以弓形蟲cDNA為模板擴增GRA10(AA 4-487)基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物大小為1452bp(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 重組質(zhì)粒pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)與原載體pE-SUMO的對比鑒定

挑取陽性克隆，在含氨芐青霉素的LB過夜震搖培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，然后和原始質(zhì)粒pE-SUMO經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對比，可見含有插入片段的陽性克隆較空載體大小增加(圖2)。

2.3 重組質(zhì)粒pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)測序鑒定

M.Marker；1.pE-SUMO;2.pE-SUMO-GRA(AA 4-487)圖2 pE-SUMO與pE-SUMO-GRA(AA 4-487) 的瓊脂糖凝膠電泳圖

將潛在的陽性重組質(zhì)粒送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果良好，彩圖顯示峰尖單一，送測的重組質(zhì)粒基因序列與原始基因序列一致，pE-SUMO與GRA10(AA 4-487)接頭部分正常(圖3)。

2.4 融合蛋白的表達

將重組質(zhì)粒的表達菌轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)后加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成后使用高壓細胞破碎儀破碎，分別取上清和沉淀同時進行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖4與圖5。誘導(dǎo)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，分子質(zhì)量約為64ku，與計算的理論分子量相符。

圖3 pE?SUMO與GRA10(AA4?487)接頭部分測序圖譜M Marker；1 包涵體；2 上清圖4 pE?SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的SDS?PAGE分析

2.5 融合蛋白pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)的Western blot 鑒定

Western blot分析顯示，融合蛋白pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)能被His-Tag的小鼠單克隆抗體抗體識別(圖6)，說明目的蛋白能夠正常表達并被識別。

Western blot分析顯示，融合蛋白pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)能被感染弓形蟲小鼠陽性血清識別(圖7)，說明目的蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，能被陽性血清中的抗體識別，能用于弓形蟲病診斷試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

M Marker；1 包涵體；2 上清圖5 pE?SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白上清與包涵體的SDS?PAGE分析M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)3h菌液；2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo)菌液；3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)3h菌液高壓破碎上清；4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)3h菌液高壓破碎沉淀圖6 SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白HIS標(biāo)簽的鑒定M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 pE?SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白；2 陰性對照圖7 SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白被感染弓形蟲小鼠血清的識別情況

3 討論

越來越多的研究證明弓形蟲分泌細胞器分泌的致密顆粒蛋白和棒狀體與調(diào)制宿主細胞內(nèi)信號通路有關(guān)，導(dǎo)致寄生蟲可以逃避宿主免疫[3～5]。弓形蟲致密顆粒分泌的致密顆粒蛋白是一類重要的分泌代謝性抗原，在弓形蟲病原體與宿主細胞的相互作用中起重要作用。研究證明，弓形蟲致密顆粒分泌的致密顆粒蛋白即可用于弓形蟲病的診斷，又對弓形蟲的感染有一定的保護作用。

致密顆粒是一種弓形蟲頂端復(fù)合體的細胞器，可分泌致密顆粒蛋白(dense granule proteins，GRA)，其中GRA1(P24)、GRA2(P28)、GRA4(P40)、GRA6 和GRA7(P29)是5 種主要的GRA 蛋白。GRA1(P24)是慢性弓形蟲病的標(biāo)志性抗原分子，通過調(diào)節(jié)鈣離子的濃度穩(wěn)定納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)；GRA2(P28)是一個毒力相關(guān)抗原，在弓形蟲入侵宿主后誘導(dǎo)納蟲空泡(parasitophorous vacuole，PV)表面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成；GRA4(P40)、GRA6和GRA7(P29)在修飾調(diào)理PV的過程中起重要作用，參與PV網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，參與蟲體在細胞內(nèi)的存活和復(fù)制，研究發(fā)現(xiàn)這些分子的DNA 疫苗或重組抗原可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一定的保護力，提示GRA1、GRA2、GRA4、GRA6和GRA7抗原是5個有希望的疫苗分子[6～10]。但它們產(chǎn)生的保護力通常較低，遠遠未達到人們所期望的水平，因此人們將對弓形蟲的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)進行深入研究，從而弄清弓形蟲抗原的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，選擇更有效的候選基因或編碼該基因的相關(guān)表位以及合適的表達載體，構(gòu)建多價高效的復(fù)合基因疫苗或含有基因佐劑的混合基因疫苗或多表位疫苗；研究這些疫苗的轉(zhuǎn)化效率、免疫原性、MHC 限制性以及能否長期在宿主體內(nèi)表達[11]。

GRA10是在弓形蟲高表達的保守基因。弓形蟲致密顆粒蛋白在速殖子和緩殖子中大量分泌[12]，在早期感染弓形蟲宿主的血液中可以被發(fā)現(xiàn)[13]，從而使致密顆粒蛋白成為有吸引力的候選疫苗。分析了弓形蟲GRA10蛋白的細胞定位后發(fā)現(xiàn)它密集地集中在致密顆粒中，稀疏分布于弓形蟲速殖子的胞漿和納蟲空泡內(nèi)，但沒有出現(xiàn)在納蟲空泡膜上[14]。這與膜的關(guān)聯(lián)分析是一致的，顯示了GRA10蛋白在弓形蟲細胞溶解產(chǎn)物中而不是在膜上。納蟲空泡對弓形蟲從宿主細胞中獲得營養(yǎng)物質(zhì)很重要[15]，對消除弓形蟲代謝廢物也很重要[16,17]。

綜上所述，因為弓形蟲的宿主范圍廣泛，抗原成分復(fù)雜，導(dǎo)致研究進展緩慢。而致密顆粒蛋白是弓形蟲的一種十分重要的蛋白，近年來的研究表明該蛋白對于弓形蟲病的防治有著重要的意義。本研究利用弓形蟲ME49蟲株cDNA為模板擴增GRA10(AA 4-487)的編碼片段，建立了重組質(zhì)粒pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后的表達產(chǎn)物能夠被His-Tag的小鼠單克隆抗體抗體和感染弓形蟲小鼠陽性血清識別，說明其具有免疫反應(yīng)性，從而為弓形蟲病診斷試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

如何有效防治弓形蟲病已是現(xiàn)在人們必須面對的難題，但是弓形蟲生活史非常復(fù)雜，所導(dǎo)致的機體免疫也多種多樣，弓形蟲病可由卵囊和包囊感染，而且其蛋白質(zhì)有上千種，因此找尋到具有免疫反應(yīng)性的蛋白十分重要，可以讓人們進一步了解弓形蟲病引起的機體免疫。本研究所構(gòu)建的重組GRA10(AA 4-487)蛋白可為未來防治弓形蟲病提供一定幫助，但還需要對弓形蟲不同階段、不同抗原進行更加透徹的了解，才能取得更好的療效。

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[編輯] 余文斌