高宇，沈朝斌，周霖，劉曉穎，雷蕾，曹詩燕，蔣瑾瑾

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院兒科，上海 200433；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科，上海 200082）

支氣管哮喘是兒童常見的一種呼吸道疾病，由肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等氣道炎性細(xì)胞以及結(jié)構(gòu)細(xì)胞和細(xì)胞組分參與，以氣道高反應(yīng)性和慢性氣道炎癥為主要特征，其反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，對家庭和社會造成了不可忽視的影響［1］。全球范圍內(nèi)，隨著氣候環(huán)境的惡化，哮喘的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢［2］。玉屏風(fēng)顆粒具有抗炎、抗菌、抗過敏及調(diào)節(jié)免疫功能的作用，對哮喘有一定的治療效果。為此，我科對玉屏風(fēng)顆粒治療哮喘展開相關(guān)研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—12月在第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院兒科就診的哮喘患兒120例分別納入哮喘急性發(fā)作期組及哮喘臨床緩解期組。其中哮喘急性發(fā)作期組患兒表現(xiàn)為突然發(fā)生喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀，共選取60例，其中男性36例，女性24例，年齡3.42～12.58歲，平均（7.15±2.14）歲；哮喘臨床緩解期組患兒指經(jīng)過治療或未經(jīng)治療哮喘癥狀、體征消失，肺功能恢復(fù)到急性發(fā)作前水平，并維持3個月以上，共選取60例，其中男性34例，女性26例，年齡3.83～12.42歲，平均（7.16±2.02）歲；同時選取同期來我科門診體檢的健康兒童60例為健康對照組，其中男性35例，女性25例，年齡3.75～11.75歲，平均（6.93±1.89）歲。以上三組性別、年齡組成均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究得到了第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 診斷符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）［3］哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）反復(fù)喘息、咳嗽、氣促、胸悶，多與接觸變應(yīng)原、冷空氣、物理、化學(xué)性刺激、呼吸道感染、運動以及過度通氣（如大笑和哭鬧）等有關(guān)，常在夜間和（或）凌晨發(fā)作或加劇；（2）發(fā)作時雙肺可聞及散在或彌漫性，以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長；（3）上述癥狀和體征經(jīng)抗哮喘治療有效，或自行緩解；（4）除外其他疾病所引起的喘息、咳嗽、氣促和胸悶；（5）患兒近親屬均簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 有以下情況者需排除：（1）近8周內(nèi)使過抗組胺藥物或者糖皮質(zhì)激素；（2）患兒已使用或曾使用其它中成藥或中藥湯劑；（3）用過免疫抑制劑或患有其他免疫系統(tǒng)疾病者；（4）急性發(fā)作期重癥哮喘，并需靜脈補液治療。

1.4 治療方法及療程 將60例支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒確診后均按哮喘急性發(fā)作期醫(yī)院治療流程，吸入速效β2受體激動劑聯(lián)合抗膽堿能藥物、吸入糖皮質(zhì)激素（ICS）及氧療，存在感染者予抗感染治療，待將哮喘控制進(jìn)入不需要使用糖皮質(zhì)激素的治療階段后，將患兒采用隨機數(shù)字表法隨機分為兩組，其中常規(guī)治療組30例，玉屏風(fēng)組30例，兩組患兒在性別、年齡、病程及病情輕重方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。常規(guī)治療組給孟魯斯特（順爾寧，默沙東投資有限公司），1～5歲4 mg，每晚頓服；＞5歲5 mg，每晚頓服，連續(xù)用藥8周；玉屏風(fēng)組除給予孟魯斯特治療外，聯(lián)合玉屏風(fēng)顆粒（廣東環(huán)球制藥有限公司）口服治療，3～6歲每次5 g，每日2次；＞6歲每次5 g，每日3次，持續(xù)治療8周。

1.5 實驗室指標(biāo)檢測 用實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及 Western蛋白印跡法（Western blot）檢測支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒、支氣管哮喘臨床緩解期患兒、健康對照兒童三組對象外周血單個核細(xì)胞中組胺H4R的基因含量及蛋白表達(dá)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測三組對象外周血血清人白細(xì)胞介素-12（P70）［IL-12（P70）］的含量。

用RT-PCR及Western blot檢測玉屏風(fēng)組和常規(guī)治療組治療前后外周血單個核細(xì)胞中組胺H4R的基因含量及蛋白表達(dá)，用ELISA法檢測兩組對象治療前后血清IL-12（P70）水平的變化。

1.6 主要儀器與試劑 PCR儀ViiA7（life technology ABI），電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀DYCZ-40D（北京市六一儀器廠），X射線攝影暗匣AX-II（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司），酶標(biāo)儀DNM-9602（北京普朗新科技有限公司），H4R、β-actin引物（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Biotnt），BCA蛋白定量試劑盒（Roche），IL-12（P70）ELISA試劑盒（博士德生物）。

1.7 研究方法 入組兒童均于清晨空腹采集靜脈血3 mL×2管，4℃下離心20 min，轉(zhuǎn)速3 000 r·min－1，取血清置于超低溫冰箱（－80℃）中采用ELISA法待檢IL-12（P70）水平，具體操作程序嚴(yán)格按說明書進(jìn)行；留取下層血樣，用密度梯度離心法分離并提取外周血單個核細(xì)胞，最后放置－80℃的冰箱中保存，用RT-PCR及Western blot檢測組胺H4R的基因含量及蛋白。

1.7.1 使用RT-PCR進(jìn)行H4R mRNA的檢測 在Genbank查找H4R及內(nèi)參基因的mRNA序列，采用oligo和primer5設(shè)計引物，設(shè)計好的引物由Invitrogen公司合成。H4R的引物：上游引物5′-GTC CCA TTT CTT CCT GTT-3′，下游引物 5′-GCA GTC TCT TCA CCA TCT-3′；內(nèi)參基因β-actin引物：上游引物5′-GAA ATC GTG CGT GAC ATT-3′，下游引物 5′-AGG CAG CTC GTA GCT CTT-3′。

采用Trizol一步法從細(xì)胞中提取總RNA，異丙醇法濃縮RNA，提取出的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR合成，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，再用定量PCR儀進(jìn)行定量PCR檢測。

1.7.2 使用Western blot檢測H4R的蛋白表達(dá)將樣本進(jìn)行總蛋白的提取，使用BCA系統(tǒng)進(jìn)行蛋白初定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度，利用BCA蛋白定量結(jié)果，均一化所有樣本總蛋白濃度，將樣本放入恒溫金屬浴95℃15 min，取出即可上樣電泳，電泳轉(zhuǎn)膜后，將轉(zhuǎn)膜制得的承載膜先置于TBST中浸潤，在麗春紅中染色，驗證轉(zhuǎn)膜成功后用TBST將麗春紅洗脫，進(jìn)入孵育步驟，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋過的GPADH一抗 （1∶500），4℃孵育過夜或者室溫孵育1.5 h，0.1%TBST液洗膜10 min×3次，加入對應(yīng)稀釋過的二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h洗膜10 min×3次，洗膜后加入ECL發(fā)光液，曝光，顯影，定影，此時X線片上相應(yīng)位置的黑色條帶即為最終結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件（SPSS19.0）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料，正態(tài)分布者以x±s表示。三組間結(jié)果比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，同一組別治療前后比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組對象組胺H4R mRNA的表達(dá)水平及IL-12（P70）的水平 哮喘急性發(fā)作期組患兒H4R mRNA表達(dá)明顯高于哮喘臨床緩解期組患兒、健康對照組兒童（P＜0.05），哮喘急性發(fā)作期組患兒IL-12（P70）低于哮喘臨床緩解期組患兒、健康對照組兒童，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘臨床緩解期組患兒H4R mRNA及IL-12（P70）與健康對照組兒童差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 哮喘急性發(fā)作期、臨床緩解期、健康對照組H4R mRNA及 IL-12（P70）的表達(dá)

2.2 三組對象組胺H4R的蛋白表達(dá) 見圖1。哮喘急性發(fā)作期組患兒H4R的蛋白表達(dá)均高于哮喘臨床緩解期組患兒及健康對照組兒童，哮喘臨床緩解期組患兒H4R蛋白表達(dá)與健康對照組兒童無明顯差異。H4R的蛋白表達(dá)結(jié)果與H4R mRNA表達(dá)結(jié)果一致。

圖1 哮喘急性發(fā)作期、臨床緩解期、健康對照組H4R的蛋白表達(dá)

2.3 玉屏風(fēng)組和常規(guī)治療組治療前后組胺H4R mRNA的表達(dá)水平及IL-12（P70）的水平 玉屏風(fēng)組治療前H4R的mRNA、IL-12（P70）水平與常規(guī)治療組治療前水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可參照意義；玉屏風(fēng)組治療前后H4R的mRNA及IL-12（P70）水平變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；常規(guī)治療組治療前后 H4R的mRNA、IL-12（P70）水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；玉屏風(fēng)組治療后H4R的mRNA、IL-12（P70）水平與常規(guī)治療組治療后的水平變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 玉屏風(fēng)組和常規(guī)治療組治療前后組胺H4R的蛋白表達(dá)變化 見圖2。哮喘患兒玉屏風(fēng)組治療前后H4R的蛋白表達(dá)變化有差異，常規(guī)治療組治療前后H4R的蛋白表達(dá)無明顯差異。H4R的蛋白表達(dá)變化與H4R mRNA表達(dá)變化一致。

表2 玉屏風(fēng)組和常規(guī)治療組治療前后H4RmRNA及IL-12（P70）的表達(dá)變化

圖2 玉屏風(fēng)組和常規(guī)治療組治療前后H4R的蛋白表達(dá)

3 討論

支氣管哮喘是一種兒童常見的氣道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病率正在逐年上升。吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德可抑制多種細(xì)胞因子的活性而達(dá)到控制哮喘患者的呼吸道炎癥反應(yīng)和抑制重塑［4］。但臨床研究發(fā)現(xiàn)，單純應(yīng)用激素雖能較快緩解癥狀，但對于減少急性哮喘發(fā)作次數(shù)效果不大，不能改善免疫功能，長期使用可產(chǎn)生一定的副作用［5］。白三烯也參與哮喘發(fā)病的多項環(huán)節(jié)，在哮喘炎癥中發(fā)揮重要作用。白三烯受體拮抗劑可降低人半胱氨酰白三烯誘導(dǎo)的黏附分子Mac-1的表達(dá)和嗜酸性粒細(xì)胞游走遷移，抑制氣道嗜酸性粒細(xì)胞增殖和活化，減少氣道嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，抑制氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥及對多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子產(chǎn)生抑制作用［6］。但在臨床應(yīng)用中，單純使用白三烯受體拮抗劑孟魯司特控制哮喘發(fā)作效果不令人滿意。因此，調(diào)節(jié)哮喘患兒免疫功能至關(guān)重要，是預(yù)防哮喘發(fā)作、達(dá)到長期緩解和治愈的重要環(huán)節(jié)。

玉屏風(fēng)顆粒主要成分為黃芪、白術(shù)、防風(fēng)，三藥合用，猶如在人體表面形成一道屏障，使邪自祛，表自固，氣通暢［7］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明玉屏風(fēng)顆?？呻p向調(diào)節(jié)人體免疫狀態(tài)。有研究表明［8］，玉屏風(fēng)顆粒能下調(diào)血清IL-4水平、提升IFN-γ的表達(dá)水平，誘發(fā)Th1細(xì)胞應(yīng)答，抑制Th2細(xì)胞應(yīng)答，調(diào)節(jié)支氣管哮喘患者的Th1／Th2免疫失衡，從而改善支氣管哮喘的治療功效。最近又有相關(guān)研究表明玉屏風(fēng)可通過對miR-210和miR-126表達(dá)的影響抑制參與哮喘的發(fā)病機制的Th2和Th17細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)Th細(xì)胞而達(dá)到治療哮喘的功效［9］。

組胺在過敏反應(yīng)中起著重要的作用［10］。組胺的生物效應(yīng)是由組胺受體介導(dǎo)的，H4R是近來比較新發(fā)現(xiàn)的受體，具有獨特的藥理學(xué)性質(zhì)，參與了肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的趨化過程以及T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因為這些細(xì)胞都涉及哮喘的病因?qū)W，并且由于H4R在所有這些細(xì)胞中都有表達(dá)，因此提示H4R可能在哮喘發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。

2006年，Dunford等［11］發(fā)現(xiàn) H4R缺陷型小鼠和使用H4R拮抗劑的小鼠患過敏性肺炎的概率較普通小鼠減少。在H4R缺陷型小鼠中，觀察到浸潤性肺嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目和淋巴細(xì)胞的數(shù)目均減少，Th2應(yīng)答也減輕。Cowden等［12］通過小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，使用 H4R拮抗劑 JNJ7777120和JNJ28307474可通過減少IL-4、IL-6等Ⅱ類細(xì)胞因子及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等炎性因子的表達(dá)水平，可從而減少嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤及樹突狀細(xì)胞的趨化作用。這些都說明H4R可以調(diào)節(jié)Th1／Th2的平衡。

研究發(fā)現(xiàn)［13］，H4R可通過抑制核因子-κB通路下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-27，而IL-27為細(xì)胞因子IL-12家族中一員，從而使Th1細(xì)胞型更多向Th2細(xì)胞型轉(zhuǎn)化。H4R的刺激可活化轉(zhuǎn)錄因子AP-1并抑制IL-12P70水平［14］。也有研究證明H4R激活樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-12水平較低。由于IL-12是調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞分化的主要細(xì)胞因子之一，可誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，并促進(jìn)Th1分泌IFN-γ、TNF-α及IL-2等細(xì)胞因子，同時 IL-12能抑制Th2類細(xì)胞因子如IL-4、1L-5等的產(chǎn)生，從而抑制Th2型免疫應(yīng)答和氣道炎癥反應(yīng)。故IL-12水平的變化與Th1／Th2細(xì)胞亞群失衡密切相關(guān)。

本實驗發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒組胺H4R表達(dá)增高，IL-12（P70）表達(dá)降低，而處于臨床緩解期患兒與正常兒童水平無差異，說明組胺H4R、血清IL-12（P70）參與了支氣管哮喘急性期的炎癥反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)僅用孟魯司特對于哮喘患兒組胺H4R及IL-12（P70）表達(dá)無明顯影響，加用玉屏風(fēng)顆粒能明顯抑制組胺H4R的mRNA及蛋白的表達(dá)，提升IL-12（P70）水平，說明玉屏風(fēng)顆粒能抑制組胺H4R的表達(dá)，有效促進(jìn)IL-12的分泌，促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，抑制Th2合成，從而調(diào)節(jié)與哮喘發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，起到免疫調(diào)控作用。

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