馬紅艷，楊明月，徐延森，王平，李秀清，鞠英博，孫杰，杜文雅，張志剛

（滄州市人民醫(yī)院醫(yī)專院區(qū)a.病理科，b.肝膽科，河北 滄州 061000）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其高發(fā)病率和高病死率對女性的身心健康構(gòu)成了嚴重的威脅［1］。 新 輔 助 化 療 （neoadjuvant chemotherapy，NAC）也稱術(shù)前化療，作為乳腺癌綜合治療策略中的重要組成部分，已廣泛應(yīng)用于局部晚期和早期乳腺癌，可以提高手術(shù)切除率和保乳率［2］。乳腺癌干細胞（breast cancer stem cell，BCSC）是乳腺癌中具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始未分化細胞，其對放化療具有一定的抵抗作用，因此乳腺癌干細胞在乳腺癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過程中起著重要的作用［3］。除了 CD44＋／CD24－表型為乳腺癌干細胞的特異性表型標志外，近年來研究發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶 1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）不僅與乳腺癌患者的預(yù)后和耐藥有關(guān)，還可作為乳腺癌干細胞的標志物，影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［4-5］。本研究旨在探究 NAC前后乳腺癌CD44＋／CD24－與ALDH1＋表型重疊表達的比例變化，并分析化療前 ALDH1＋／CD44＋／CD24－表型與乳腺癌臨床病理特征及化療效果的關(guān)系，為臨床治療乳腺癌提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取滄州市人民醫(yī)院醫(yī)專院區(qū)2013年1月—2015年12月收治的經(jīng)巴德槍粗針穿刺活檢明確病理診斷的女性初治乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者153例，年齡27～65歲，中位年齡48歲，臨床Ⅱa～Ⅲb期，其中Ⅱ期75例，Ⅲ期78例。術(shù)前化療用藥：紫杉醇175 mg·m－2或多西他賽 75 mg·m－2，表柔比星 60 mg· m－2，或吡柔比星，環(huán)磷酰胺 500 mg·m－2，5-氟尿嘧啶 500 mg·m－2，第1天持續(xù)靜脈滴注。所有方案均3周為一個化療周期，連用3個周期。術(shù)中留取新鮮組織標本，液氮凍存并保存在－80℃冰箱。收集所有患者的臨床病理資料，并將術(shù)前針吸標本和術(shù)后標本的存檔石蠟包埋組織塊行4μm厚的組織切片。該研究已經(jīng)通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑及實驗方法 ALDH1兔抗人單克隆抗體（abcam，ab52492，1∶100），CD44鼠抗人單克隆抗體（abcam，ab51037，1∶50），CD24兔抗人單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0528R，1∶100），免疫組化檢測試劑盒 PV-9000及 Polymer雙染檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。操作步驟均參照說明書進行。

1.3 染色結(jié)果判定 由2名富有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師采用雙盲法對染色結(jié)果進行判定。ALDH1單染結(jié)果的判定參照王利平等［6］的方法，每張片子隨機選取10個視野進行觀察評分，然后取平均值，免疫組化的最后評判結(jié)果為陽性染色強度評分和陽性細胞百分比評分的乘積，然后對應(yīng)相應(yīng)的等級。陽性染色強度評分標準：0分：－；1分：＋；2分：＋＋，；3分：＋＋＋。陽性染色強度評分標準為：0分：無陽性細胞；1分：陽性細胞比例 ＜25%，；2分：26% ～50%；3分：51%～75%；4分：陽性細胞比例＞75%。最后結(jié)果為，0～3分：－；4～5分：＋；6～7分：＋＋；8分以上：＋＋＋。其中－為陰性表達，＋～＋＋＋為陽性表達。CD44／CD24雙染結(jié)果的判定參照曾妮等［7］的方法進行判定，判定標準為：CD44陽性細胞為細胞膜棕黃色，CD24陽性細胞為細胞質(zhì)紅色，雙染結(jié)果細胞膜呈棕黃色胞質(zhì)或胞膜無紅色信號干擾的細胞鑒定為 CD44＋／CD24－。結(jié)果：無 CD44＋／CD24－細胞為0分；CD44＋／CD24－細胞比例為 1% ～＜10%：1分；CD44＋／CD24－細胞比例為 10% ～＜50%：2分；CD44＋／CD24－細胞比例為 50% ～＜75%：3分；CD44＋／CD24－細胞比例為75%～100%：4分。最終將0分視為 CD44＋／CD24－表型陰性，≥1分視為CD44＋／CD24－表型陽性。綜合同一組織標本的ALDH1單染結(jié)果及CD44／CD24的雙染結(jié)果，將同時具有 ALDH1＋和 CD44＋／CD24－表 型 的 標 本 視 為CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型陽性，其余為陰性。

1.4 療效評價 參照世界衛(wèi)生組織（WHO）實體瘤療效評價標準對療效進行評價：臨床完全緩解（cCR），病理完全緩解（pCR），部分緩解（cPR），穩(wěn)定（SD），進展（PD），cCR＋pCR為有效，SD＋PD為無效。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用的方法主要為χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1和 CD44／CD24在乳腺癌組織中的表達情況 ALDH1蛋白在乳腺癌組織細胞中的著色部位為細胞質(zhì)，染色為棕黃色，CD44陽性細胞為細胞膜棕黃色：CD24陽性細胞為細胞質(zhì)紅色，雙染結(jié)果為CD44＋／CD24－表型時細胞膜呈棕黃色胞質(zhì)或胞膜無紅色信號干擾。

2.2 NAC前后乳腺癌組織標本中CD44／CD24／ALDH1的表達情況 NAC前，乳腺癌組織中ALDH1＋表型的比例為23.5%，CD44＋／CD24－表型的比例為40%；CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的比例為7.2%；NAC后乳腺癌組織中ALDH1＋表型的比例為43.8%，CD44＋／CD24－表型的比例為75.8%；CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的比例為22.9%。經(jīng)χ2檢驗，NAC后 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的比例均較化療前均有顯著升高，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 NAC前ALDH1和CD44／CD24的表達情況與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 NAC前ALDH1的表達與腫瘤大小、臨床分期、脈管癌栓、雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）有顯著相關(guān)性（P＜0.05），與年齡、絕經(jīng)狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；CD44／CD24的表達與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、ER、HER-2有顯著相關(guān)性（P＜0.05），與年齡、絕經(jīng)狀況、PR無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的表達與腫瘤大小、脈管癌栓、HER-2有顯著相關(guān)性（P＜0.05），與年齡、絕經(jīng)狀況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見表2。

2.4 NAC前乳腺癌組織標本中CD44／CD24／ALDH1的表達與化療療效的關(guān)系 NAC前，乳腺癌組織中ALDH1的表達與NAC效果無顯著相關(guān)性（χ2＝0.618，P＝0.432）；CD44＋／CD24－表型與NAC效果也無顯著相關(guān)性（χ2＝2.399，P＝0.121）；而CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型與 NAC效果存在顯著相關(guān)性，且 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型能提示患者良好的預(yù)后（χ2＝5.748，P＝0.017）。見表3。

表1 NAC前后乳腺癌組織標本中 CD44、CD24、ALDH1的表達情況／［n＝153，例（%）］

表2 NAC前CD44、CD24、ALDH1的表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系（n＝153，例）

表3 NAC前乳腺癌組織標本中CD44、CD24、ALDH1的表達與化療療效的關(guān)系／［n＝153，例（%）］

3 討論

乳腺癌是全球范圍內(nèi)最為常見的女性腫瘤之一，已經(jīng)成為一個非常嚴重的危害公眾健康的問題［8］。盡管有報道顯示在發(fā)達國家乳腺癌5年生存率已經(jīng)明顯提高，但是乳腺癌仍為美國第二大致死性腫瘤［8］。據(jù)統(tǒng)計，在美國2016年約有249 000例新確診乳腺癌患者，預(yù)計因乳腺癌而死亡的患者數(shù)量將達到40 500例［8］。在發(fā)展中國家，乳腺癌患者的5年生存率大約為50%～60%［9］。目前乳腺癌的治療方法主要有手術(shù)切除、放療、輔助性內(nèi)分泌治療、化療等，而NAC的應(yīng)用也越來越受到大家的重視［9］。研究表明，NAC能夠在術(shù)前減少局部晚期乳腺癌的腫瘤細胞活性，減少遠處轉(zhuǎn)移的機會并減少腫瘤耐藥的發(fā)生，從而為后續(xù)的手術(shù)治療創(chuàng)造條件，增加保乳機會同時減少了手術(shù)的難度和并發(fā)癥的發(fā)生［6，10］。此外，NAC還可以用來評估乳腺癌患者的腫瘤化療敏感性，以便后續(xù)治療時及時調(diào)整治療策略和方案［2，11］。盡管目前乳腺癌的診療手段已經(jīng)取得了一定的進步，但是乳腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量的狀況仍然不容樂觀。因此，尋找新的臨床有效的診治乳腺癌的策略是當(dāng)前非常緊要的任務(wù)之一。

腫瘤干細胞是腫瘤細胞中具有自我更新、多向分化以及導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一群細胞，近年來關(guān)于乳腺癌干細胞（BCSCs）的研究也日益增多［12-13］。由于乳腺癌中可能存在一定比例的乳腺癌干細胞，使得乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，從而導(dǎo)致乳腺癌患者的預(yù)后較差。研究發(fā)現(xiàn)，作為乳腺癌干細胞的特異性表型標志之一，CD44＋／CD24－可以預(yù)測乳腺癌患者的預(yù)后［14-15］。ALDH1是一種細胞溶質(zhì)酶，不僅與組織和器官的分化和基因的表達相關(guān)，還可作為腫瘤干細胞包括乳腺癌干細胞的標志物影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［15］。雖然目前關(guān)于ALDH1＋和 CD44＋／CD24－這兩種不同類型的乳腺癌干細胞標志的表達情況的研究以及對化療的反應(yīng)情況的研究較多，但是尚存在一定的爭議［15-18］。如楊俊娥［16］研究發(fā)現(xiàn)，化療會導(dǎo)致乳腺癌組織中ALDH1＋表型增加；魏素菊等［17］研究發(fā)現(xiàn)化療可使乳腺癌患者外周血中CD44＋CD24－／low細胞含量降低；而韋偉研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的外周血中CD44＋CD24－／low表型的乳腺癌干細胞比例經(jīng)化療藥物的刺激后明顯上調(diào)［18］。再者，目前關(guān)于兩者在乳腺癌組織中的重疊表達情況以及其與化療之間的相關(guān)性的研究尚比較罕見。因此，我們開展了此次研究。

本研究首先應(yīng)用免疫組化單染和雙染的方法分別檢測了ALDH1＋和CD44＋／CD24－兩種表型在NAC前后乳腺癌組織細胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)ALDH1蛋白在乳腺癌組織細胞中的著色部位為細胞質(zhì)，ALDH1＋表型的細胞染色為棕黃色，CD44陽性細胞為細胞膜棕黃色：CD24陽性細胞為細胞質(zhì)紅色，雙染結(jié)果為 CD44＋／CD24－表型的細胞膜呈棕黃色胞質(zhì)或胞膜無紅色信號干擾。

接著，我們對153例患者的乳腺癌組織中ALDH1＋、CD44＋／CD24－和 CD44＋／CD24－／ALDH1＋三種表型的細胞染色情況進行了統(tǒng)計分析和比較。我 們 發(fā) 現(xiàn)，NAC 后 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的比例均較 NAC前顯著升高，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié) 果 說 明，ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的表達與NAC具有相關(guān)性，且NAC可以促進這三種表型的乳腺癌干細胞比例增加。而這種NAC后乳腺癌干細胞富集狀態(tài)的出現(xiàn)可能是由于乳腺癌干細胞多處于細胞增殖的靜止期即未進入細胞增殖周期，而絕大多數(shù)的化療藥物一般都是作用于處于增殖周期的腫瘤細胞，從而使得 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的乳腺癌干細胞細胞可以逃避化療藥物的作用，表現(xiàn)出對化療藥物的抵抗性。

為了探究 NAC前 ALDH1＋、CD44＋／CD24－表型重疊表達與乳腺癌臨床病理特征間的關(guān)系，我們分 別 統(tǒng) 計 分 析 了 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋三種表型分別于乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH1的表達與腫瘤大小、臨床分期、脈管癌栓、ER、PR有顯著相關(guān)性（P＜0.05），而與年齡、絕經(jīng)狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；CD44／CD24的表達與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、ER、HER-2有顯著相關(guān)性（P＜0.05），而與年齡、絕經(jīng)狀況、PR無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的表達與腫瘤大小、脈管癌栓、HER-2有顯著相關(guān)性（P＜0.05），而與年齡、絕經(jīng)狀況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。說明 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有一定的相關(guān)性，即 CD44＋／CD24－／ALDH1＋的表型可能可以用來預(yù)測患者臨床預(yù)后及治療的指標。

為了探究 NAC前乳腺癌干細胞中 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型是否可以用來預(yù)測NAC的效果，我 們 對 表 型 為 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋的化療效果分別進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC前，乳腺癌組織中ALDH1的表達及CD44＋／CD24－表型與NAC效果均無顯著相關(guān)性；而 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型與 NAC效果存在顯著相關(guān)性，且 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型比例越高，患者的化療效果越好。上述結(jié)果表明，CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型可能可以作為預(yù)測患者化療效果的臨床指標，而具體作用及機制尚待進一步更深入的實驗加以探究證實。

綜上，NAC可以促進乳腺癌組織中 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表 型 比 例 的 增 加，而 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型可以增加患者的化療效果的有效率，因此 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型監(jiān)測有望成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的臨床指標。

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