孟冬霞，劉曉東，武果桃，任 杰，衛(wèi)順生，馬政禹，趙 娟，夏艷婷

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032；2.山西科元動物胚胎工程中心，太原 030032；3.武鄉(xiāng)縣畜牧綜合執(zhí)法大隊，長治 046300；4.山西農(nóng)業(yè)大學，晉中 030801）

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（Haemo philus parasuis,Hps）引起的豬的多發(fā)性漿膜炎和關節(jié)炎，特點為高熱、關節(jié)腫脹、中樞神經(jīng)癥狀及呼吸道紊亂。臨床癥狀主要表現(xiàn)為被毛粗亂、消瘦、咳嗽、發(fā)熱、呼吸困難、跛行及共濟失調(diào)等，2周齡到4月齡的豬均易感，通常見于5～8周齡的豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴重時死亡率可達50%[1-2]，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。

阿莫西林又名羥氨芐青霉素，屬半合成廣譜抗生素，是獸醫(yī)臨床中應用最普遍的抗生素之一。其抗菌機理是干擾敏感細菌細胞壁黏肽的合成，抑制細菌的代謝酶，觸發(fā)細菌自身的自溶酶活性，使細菌腫脹、變形破裂、溶解死亡。由于阿莫西林水溶性不好，臨床應用時易造成藥物損失，無形中增加養(yǎng)殖成本。為提高阿莫西林溶解度及生物利用度，利用煙酸和阿莫西林通過混合法制備煙酸阿莫西林可溶性粉，為驗證其對敏感菌所致副豬嗜血桿菌病的療效特進行本試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品、標準菌株與主要試劑

阿莫西林（含量為99.9%，批號為101150510112），華北某有限公司生產(chǎn)；煙酸（含量為99.8%，批號為151203），天津某公司生產(chǎn)；煙酸阿莫西林可溶性粉，由GMP獸藥廠太原市奧福萊動物藥業(yè)有限公司根據(jù)項目組提供的原料及配方進行生產(chǎn)。將其用生理鹽水稀釋至所需濃度，用0.22 μm濾膜過濾除菌（過濾后對其活性無影響，熱原物質(zhì)均能達到肌肉注射標準，無菌檢測合格），供肌肉注射用。氨芐西林可溶性粉（10%，批號為20151221）、注射用氨芐西林鈉（1.0 g，批號為20151124），某有限公司生產(chǎn)。

金黃色葡萄球菌標準菌株，購自中國獸藥監(jiān)察所；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、藥敏紙片、微量生化鑒定管購于杭州微生物試劑有限公司；配制TSA平板、TSB肉湯時，分別添加NAD（煙酸胺腺嘌呤二核苷酸）和犢牛血清；NAD購自生工生物工程（上海）股份有限公司；犢牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；煙酸阿莫西林藥敏紙片自制；細菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、DL 2 000 DNA Marker等購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗動物、分組及給藥方法

2017年6月13—17日進行治療試驗。在武鄉(xiāng)縣上司鄉(xiāng)某豬場，選擇自然發(fā)病、確診為副豬嗜血桿菌病、有治療價值、出生后均未接種過副豬嗜血桿菌疫苗、體重11.7～15.6 kg、41～52日齡的杜長大病豬162頭，隨機分為9組，每組18頭，分別為煙酸阿莫西林混飲高劑量組，每100 kg水中加入本品15 g，1 d 2次，連用5 d；煙酸阿莫西林混飲中劑量組，每100 kg水中加入本品10 g，1 d 2次，連用5 d；煙酸阿莫西林混飲低劑量組，每100kg水中加入本品5g，1 d 2次，連用5 d；煙酸阿莫西林肌注高劑量組，20 mg/kg體重，1 d 2次，連用5 d；煙酸阿莫西林肌注中劑量組，15 mg/kg體重，1 d 2次，連用5 d；煙酸阿莫西林肌注低劑量組，10 mg/kg體重，1 d 2次，連用5 d；氨芐西林混飲組及氨芐西林肌注組，按說明書用量進行給藥；感染對照組；另取18頭健康豬作為健康對照組。用藥前測量直腸溫度并觀察臨床癥狀。

1.3 副豬嗜血桿菌病的診斷方法

1.3.1 診斷 根據(jù)流行病學調(diào)查、臨診癥狀、病理變化進行初步診斷，結(jié)合實驗室檢測進行確診。

1.3.2 細菌分離、純化 無菌采集5頭病死豬（死前未用過抗生素、死亡不超過12 h）肺臟表面的纖維素性滲出物及心包液，接種于含50 mL/L犢牛血清和10 μg/mL NAD的TSA上，置5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)基，觀察菌落狀態(tài)，挑取可疑菌落進行純培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色鏡檢。

1.3.3 衛(wèi)星現(xiàn)象試驗 挑取分離菌株單個菌落，水平劃線于鮮血瓊脂平板上、再挑取金黃色葡萄球菌垂直劃線，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察是否有衛(wèi)星生長現(xiàn)象、是否有溶血現(xiàn)象。

1.3.4 生化試驗 挑取具有衛(wèi)星生長現(xiàn)象且不溶血的單個菌落純培養(yǎng)后接種于過氧化氫酶（觸酶試驗）、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、甘露醇、尿素酶等細菌生化微量鑒定管中，并在每只管中加入終濃度為40 μg/mL NAD，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察結(jié)果。

1.3.5 PCR鑒定（16S rRNA基因特異性檢測）

（1）細菌基因組提?。喝〖兓蟮膯我痪浣臃N于含50 mL/L犢牛血清和10 μg/mL NAD的TSB液體培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)過夜。采用參照文獻[3]的CTAB/NaCl方法提取細菌基因組DNA，干燥后溶于TE中-20℃保存，作為PCR擴增模板。

（2）引物設計及合成：參照文獻[4]設計引物，引物序列為 P1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′；P2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，預期片段大小為822 bp，引物由上海生工合成。

（3）16S rRNA基因的PCR擴增：把提取的細菌DNA作為模板擴增16S rRNA基因。PCR反應體系為 25 μL：10×Taq Reaction Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Tap 0.25 μL，上下游引物各 1.5 μL，模板 0.25 μL，用ddH2O補充至25 μL。反應條件為：95℃預變性 5 min，94℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。結(jié)束反應后，取PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。1.3.6 血清型鑒定 按Kielstein-Rapp-Gabriedson（KRG）[5]瓊脂擴散血清分型方法對分離的Hps菌株進行血清分型，Hps分型血清由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.3.7 藥敏試驗 用紙片法檢測細菌對藥物的敏感度。將分離純化的2株細菌，分別接種于含NAD及犢牛血清的TSA平板上培養(yǎng)24～48 h，用TSB洗脫，渦旋，稀釋為0.5麥氏渾濁度，再均勻涂抹于TSA平板，貼上藥敏紙片，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24～48 h后，測量抑菌圈大小。

1.4 評價指標

1.4.1 治愈率 試驗期間，病豬用藥后精神、食欲、體溫、呼吸等恢復正常，臨床癥狀消失，增重接近或超過健康對照組豬的比率。

1.4.2 有效率 試驗期間，病豬用藥后體溫升高、呼吸困難、咳嗽等癥狀與健康對照組相比明顯減輕或消失的豬的比率。

1.4.3 無效率 試驗期間，病豬用藥后臨床癥狀與健康對照組相比未減輕或消失以及死亡的豬的比率。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

死亡率、有效率、治愈率用t檢驗法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初步診斷

發(fā)病豬日齡為41～52 d。病豬主要表現(xiàn)為食欲下降、消瘦、被毛凌亂、精神沉郁、咳嗽、呼吸困難、腕關節(jié)及跗關節(jié)腫脹、跛行、共濟失調(diào)、耳稍發(fā)紫、眼結(jié)膜發(fā)紺等癥狀。病死豬剖檢可見多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關節(jié)炎。胸腔、腹腔、心包腔、關節(jié)腔內(nèi)有纖維素性或漿液纖維素性滲出物；肺表面有纖維素性滲出物，肺與胸腔發(fā)生粘連。心包增厚，心包上有大量纖維素附著，心包內(nèi)有黃色積液。胸膜、腹膜、肝、脾及腸系膜表面可見漿液性和膿性纖維蛋白滲出物?？沙醪皆\斷為副豬嗜血桿菌病。

2.2 實驗室檢查

2.2.1 細菌分離、染色、鏡檢結(jié)果 將分離純化的疑似細菌純化培養(yǎng)48 h后，可見針尖大小、無色透明、濕潤光滑的菌落。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察可見革蘭氏陰性菌，呈短桿狀、桿狀、球狀等多種形態(tài)。

2.2.2 衛(wèi)星現(xiàn)象試驗結(jié)果 呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，金黃色葡萄球菌雙側(cè)出現(xiàn)邊緣整齊、針尖大小、圓形的菌落，離金黃色葡萄球菌越近菌落生長越好，越遠菌落越小，甚至不見菌落生長。因金黃色葡萄球菌在生長過程中可合成V因子，并在培養(yǎng)基中擴散，所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象；同時沒有發(fā)生溶血現(xiàn)象。

2.2.3 生化試驗結(jié)果 由表1可知，本菌脲酶陰性，氧化酶陰性，H2S、吲哚試驗陰性，觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麥芽糖，不發(fā)酵甘露醇、山梨醇、棉子糖。符合副豬嗜血桿菌的生理生化特性。

表1 生化試驗結(jié)果

2.2.4 PCR鑒定結(jié)果 根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設計引物，擴增后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見目的片段處于750～1 000 bp之間，與預期PCR擴增產(chǎn)物片段822bp大小一致。

2.2.5 血清型鑒定結(jié)果 分離的2株副豬嗜血桿菌經(jīng)血清型鑒定，得到4型1株、5型1株，表明分離株仍屬我國目前的優(yōu)勢菌型4型及5型。

2.2.6 藥敏試驗結(jié)果 由表2可知，兩株Hps分離菌株的藥物敏感性基本一致，對恩諾沙星、紅霉素、慶大霉素耐藥，對環(huán)丙沙星、氟苯尼考中敏；對氨芐西林、頭孢氨芐、利福平、煙酸阿莫西林高敏。

表2 藥敏試驗結(jié)果

2.2.7 治療效果 感染對照組與健康對照組相比，病豬體溫升高1～1.8℃，耳稍發(fā)紫、眼結(jié)膜發(fā)紺，精神沉郁，被毛粗亂，食欲不振或廢絕，發(fā)病后2～3 d，出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難、腕關節(jié)及跗關節(jié)腫脹、跛行、共濟失調(diào)等癥狀。死亡8頭，死亡率為44.4%。剖檢病死豬可見多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關節(jié)炎。胸腔、腹腔、心包腔、關節(jié)腔內(nèi)有纖維素性或漿液纖維素性滲出物，伴有胸水、腹水及關節(jié)腔積液；肺表面有纖維素性滲出物，肺與胸腔發(fā)生粘連。心包增厚，心包上有大量纖維素附著，心包內(nèi)有黃色積液。胸膜、腹膜、肝、脾及腸系膜表面可見漿液性和膿性纖維蛋白滲出物。

用藥組與感染對照組相比，臨床癥狀明顯減輕，一般給藥2～3 d后，多數(shù)豬的體溫、食欲基本恢復正常。治療效果見表3。由表3可知，煙酸阿莫西林組，混飲給藥時死亡率達16.7%～22.2%、有效率達77.8%～83.3%、治愈率達61.1%～72.2%，肌肉注射時死亡率達5.6%～16.7%、有效率達83.3%～94.4%、治愈率達77.8%～94.4%；氨芐西林混飲給藥時死亡率達16.7%、有效率達83.3%、治愈率達66.7%，肌肉注射時死亡率達5.6%、有效率達94.4%、治愈率達83.3%；由此可見治療時肌肉注射比混飲給藥效果要好。煙酸阿莫西林中、高劑量組肌肉注射死亡率、有效率均為5.6%、94.4%，高劑量治愈率94.4%，高于中劑量組88.9%。經(jīng)t檢驗分析，煙酸阿莫西林中、高劑量肌肉注射組及氨芐西林肌肉注射組的死亡率均顯著低于感染對照組（P＜0.05）；各治療組之間死亡率、有效率、治愈率差異均不顯著（P＞0.05）。表明臨床治療時，可選用氨芐西林或煙酸阿莫西林肌肉注射，1 d 2次，連用5 d，煙酸阿莫西林的劑量以15～20 mg/kg體重為宜。

表3 副豬嗜血桿菌病的藥物治療結(jié)果

3 討論

副豬嗜血桿菌根據(jù)莢膜抗原的差異可分為至少15個血清型，約25%的分離株無法定型。不同血清型毒力存在較大差異，其中 1、5、10、12、13、14 型為高毒力株，可引起急性死亡；2、4、8、15型為中等毒力株，可引起漿膜炎和關節(jié)炎；血清 3、6、7、9 和11型為低毒力株，感染后豬沒有明顯臨床癥狀[2]。雖然血清型與毒力存在一定關系，但同一血清型，毒力也不盡相同。各個血清型之間、同一血清型之間的交叉保護力存在差異，故疫苗不能很好地預防此病[6]。近年來關于此病的報道[7-12]屢見不鮮，給養(yǎng)殖戶造成了嚴重的經(jīng)濟損失。本項目中分離的副豬嗜血桿菌1株為高毒力，1株為中等毒力，用煙酸阿莫西林可溶性粉治療后，中、高劑量組肌肉注射的有效率為94.4%，高于混飲的有效率83.3%。臨床用于治療時建議肌肉注射，15～20 mg/kg體重，1 d 2次，連用5 d，以便盡早控制病情，減少損失。對于受副豬嗜血桿菌病威脅的豬群，可混飲給藥以降低發(fā)病率和死亡率。

使用抗生素是目前治療和控制副豬嗜血桿菌病的主要措施。但是抗菌藥物長期、廣泛和不合理使用及抗菌藥物的選擇壓力等勢必導致耐藥菌株的不斷增多，耐藥譜日益擴大[13]。建議用藥前先進行藥敏試驗，選用敏感藥物定期輪換使用，以最大限度地降低其耐藥性。遇天氣驟變、長途運輸?shù)葢r豬易發(fā)生副豬嗜血桿菌病，平時應當加強飼養(yǎng)管理，改善豬舍環(huán)境，減少應激。

副豬嗜血桿菌的分離鑒定是本病的一種可靠診斷方法，分離副豬嗜血桿菌時必須注意以下幾點：病料不能采自使用過抗生素治療的豬；豬死亡時間不能超過12 h；病料必須是新鮮的組織，不能凍存；采集的病料在4～6 h冷藏條件下送實驗室；培養(yǎng)基中必須加入NAD和犢牛血清，否則分離率大幅降低。PCR檢測時用組織直接檢測，敏感度略低，可直接使用分離和純化的細菌、液體培養(yǎng)的菌液或纖維素性滲出物。

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