許春平+孟丹丹+冉盼盼

摘要：通過(guò)正交試驗(yàn)，利用產(chǎn)香酵母對(duì)煙草花蕾進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，然后對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行美拉德反應(yīng)，利用同時(shí)蒸餾萃取方法提取香味成分后用GC-MS分析香味成分。結(jié)果表明，香味物質(zhì)主要有63種，其中軟脂酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、苯甲醇、苯乙醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮等香氣濃度大；巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香氣閾值低，是煙草中關(guān)鍵的致香物質(zhì)，對(duì)煙草香氣貢獻(xiàn)突出。以香氣總量為指標(biāo)，35 ℃、pH=5、12 h、6%（V/V）接種量時(shí)香氣總量最高，高達(dá)760.74 μg/g。以水溶性氨基酸和水溶性還原糖的含量為指標(biāo)，發(fā)酵處理在35 ℃、pH=5、24 h、5%（V/V）接種量時(shí)氨基酸含量和還原糖含量最高，分別為2.860 52、0.151 24 mg/g。香氣含量與氨基酸和還原糖含量的關(guān)系不是正相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)香酵母發(fā)酵；美拉德反應(yīng)；煙草花蕾；工藝

中圖分類號(hào)：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）01-0100-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.026

Abstract： Aroma-producing yeast was used to carry out to optimize the fermentation with tobacco bud by orthogonal design. Maillard reaction was carried out. Then，the aroma components was extracted by simultaneous distillation extraction method， and the aroma components were analyzed by GC-MS. The results showed the aroma components were mainly included 63 kinds，and myristic acid，myristic acid，dihydroactinidiolide，phytone，damascenone，megastigmatrienone，caryophyllene oxide，cembrene，oleic acid amide and 2-pentylfuran with lower odor threshold were the key aroma compounds in tobacco with outstanding contribution to tobacco aroma. Taking the total aroma amount as the index，under the optimal fermentation condition of 35 ℃，pH=5，12 h with 6% inoculating amount， the total aroma amount reached the highest level of 760.74 μg/g. Taking the contents of water-soluble amino acid and water-soluble reducing sugar as the index，under the fermentation condition of 35 ℃，pH=5，24 h with 5% inoculating amount，the contents of amino acid and reducing sugar reached the highest level. The highest amino acid content reached 2.860 52 mg/g，while the highest sugar content could reach 0.151 24 mg/g. The relationship between aroma content and amino acid and reducing sugar contents was not positively correlated.

Key words： aroma producing yeast； maillard reaction； tobacco bud； processing

煙葉發(fā)酵是卷煙加工中重要的環(huán)節(jié)，良好的發(fā)酵工藝可以改善煙葉品質(zhì)，未經(jīng)發(fā)酵處理的煙葉不同程度地有多種品質(zhì)缺陷，生青雜氣和刺激性突出，沒(méi)有陳化煙葉的特征香氣，香氣質(zhì)單調(diào)，香氣量不足，不能直接用來(lái)生產(chǎn)卷煙。通過(guò)發(fā)酵后，煙葉青雜氣和刺激性下降，煙草特征香氣顯露，可用性顯著提高，因此煙葉最好經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理用于卷煙[1-3]。根據(jù)發(fā)酵條件和方法的不同，煙草發(fā)酵被分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵，自然發(fā)酵是在庫(kù)房室溫條件下將煙葉貯存一段時(shí)間，在自然條件下陳化煙葉，使煙葉更符合吸食要求[4-6]。這種發(fā)酵方法被歐美和中國(guó)云南普遍采用。人工發(fā)酵是在特定的人工強(qiáng)化溫度和空氣濕度的發(fā)酵室內(nèi)，加速陳化煙葉，使其更適合吸食要求的發(fā)酵方式。這種方法是20世紀(jì)50年代前蘇聯(lián)科學(xué)家發(fā)明并在東歐和中國(guó)被推廣應(yīng)用的一種發(fā)酵方法[7]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外利用微生物增加煙葉香氣的研究，已有報(bào)道。朱大恒等[8]報(bào)道了以1株產(chǎn)香菌的發(fā)酵產(chǎn)物作為香料可使卷煙品質(zhì)明顯改善，煙氣醇和而飽滿，能減輕卷煙雜氣和刺激性，并用煙末、豆粕、煙秸桿等作為產(chǎn)香菌的發(fā)酵物，生產(chǎn)香精應(yīng)用于煙葉發(fā)酵，效果比較明顯。鄭小嘎等[9，10]分析了人工發(fā)酵煙葉增香途徑的研究進(jìn)展，并利用真菌菌劑處理上部葉烤煙煙絲，處理后煙葉香氣質(zhì)提高，香氣量增加，刺激性減小，余味舒適，煙葉品質(zhì)明顯提高。周瑾等[11]發(fā)現(xiàn)菌株u-81能有效地將煙葉中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸，再加外源葡萄糖在一定溫度下發(fā)生反應(yīng)提升煙葉品質(zhì)。左天覺(jué)等[12]證實(shí)煙葉中的煙堿含量不僅與煙草的品種、產(chǎn)地、氣候、施肥等有關(guān)，也與后期工藝水平以及微生物的處理有關(guān)。本試驗(yàn)利用產(chǎn)香酵母處理煙草花蕾制備煙用香料，并利用GC-MS對(duì)其進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，為進(jìn)一步研究煙用香料提供參考。endprint

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料云煙87煙草花蕾；釀酒高活性酵母；葡萄糖、谷氨酸、磷酸氫二鈉、磷二氫鈉、3，5-二硝基水楊酸鈉、丙二醇、1 mol/L NaOH、1 mol/L H2SO4、二氯甲烷、0.821 1 mg/mL乙酸苯乙酯等。

儀器：Q-100A3型旗箭粉碎機(jī)（上海冰都電器有限公司），HS-4型恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠），PL203型電子分析天平（0.000 1 g），RIGOL UItra-3400型紫外分光光度計(jì)（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），DGX-9143型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海?，斣O(shè)備有限公司），BIORIDGE盧湘儀TGL-16M離心機(jī)，蒸餾萃取裝置（鄭州科技玻璃儀器廠），6890/5973型氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)香酵母活化方法 將產(chǎn)香酵母用35～40 ℃的水活化15～20 min，然后溫度降至34 ℃以下活化1～2 h。將10 g產(chǎn)香酵母放入250 mL的錐形瓶中，加入100 mL 35～40 ℃的無(wú)菌水在32 ℃的水浴鍋中活化2 h，備用。

1.2.2 煙草花蕾滅菌處理方法 將干燥的云煙87煙草花蕾粉碎，過(guò)60目篩，置于500 mL錐形瓶中以料液比1∶10的比例加入200 mL去離子水。放入水浴鍋中沸水浴30 min達(dá)到滅菌效果。

1.2.3 發(fā)酵條件正交優(yōu)化試驗(yàn) 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)香酵母發(fā)酵條件（溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵pH、加菌量）進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)水平與因素見(jiàn)表1。

1.2.4 DNS法測(cè)定還原糖 采用DNS法測(cè)定水溶性還原糖：配制3，5-二硝基水楊酸鈉試劑（DNS），將6.5 g的3，5-二硝基水楊酸鈉和2 mol/L NaOH加到500 mL含有182 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g苯酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加去離子水定容至1 000 mL，貯存于棕色瓶中室溫放置7～10 d后標(biāo)定使用。取1.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按表2加入試劑沸水浴中加熱5 min，冷水冷卻后定容至25 mL搖勻，在520 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。測(cè)得還原糖數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=0.418 2x+0.008 7，R2=0.997 3。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計(jì)算還原糖含量，計(jì)算公式：還原糖含量（mg/g）=（還原糖濃度×稀釋倍數(shù)）/樣品質(zhì)量。

1.2.5 茚三酮法測(cè)定氨基酸 采用茚三酮法測(cè)定水溶性氨基酸：茚三酮顯色液，2 g茚三酮加入100 mL去離子水溶解，放入棕色瓶中保存，每次使用前配置；pH 8緩沖液，0.2 mol/L Na2HPO4 94.7 mL與0.2 mol/L NaH2PO4 5.3 mL合并，混勻。取0.2 mg/mL谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按表3加入試劑沸水浴中加熱15 min，冷水冷卻后定容至10 mL搖勻，在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。測(cè)得氨基酸數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程為y=0.550 9x-0.210 6，R2=0.992 9。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計(jì)算氨基酸含量，計(jì)算公式：氨基酸含量（mg/g）=（氨基酸濃度×稀釋倍數(shù)）/樣品質(zhì)量。

1.2.6 美拉德反應(yīng)處理方法 在酶解試驗(yàn)后的樣品中各加入20 mL丙二醇，調(diào)pH為7（1 mol/L NaOH調(diào)至pH=7）用封口膜封口放入烘箱，70 ℃反應(yīng)12 h[13-15]。

1.2.7 同時(shí)蒸餾萃取提取香味物質(zhì) 將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物倒入同時(shí)蒸餾萃取裝置一端的平底燒瓶中，加入100 mL去離子水，用電子調(diào)溫電熱套加熱，裝置的另一端蒸餾瓶中注入50 mL二氯甲烷，于60 ℃水浴中加熱。同時(shí)蒸餾萃取當(dāng)水與二氯甲烷分層開始計(jì)時(shí)2.5 h后萃取結(jié)束，在二氯甲烷萃取液中加入含量為0.821 1 mg/mL的乙酸苯乙酯1 mL和無(wú)水硫酸鈉若干，靜置過(guò)夜。然后于35～40 ℃條件下濃縮。濃縮至約1 mL轉(zhuǎn)至樣品瓶中，低溫密封保存，用于GC-MS進(jìn)行定量分析[16]。

1.2.8 GC-MS條件 色譜條件，色譜柱為HP-5MS 色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度280 ℃，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL，載氣為氦氣，載氣流量為3 mL/min，升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，以4 ℃/min升至280 ℃。質(zhì)譜條件，EI源，接口溫度270 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃。采集模式，掃描[17]，質(zhì)量掃描范圍35～550 m/z。揮發(fā)性物質(zhì)含量（μg/g）=（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量×揮發(fā)性物質(zhì)峰面積×1 000）/（煙草花蕾質(zhì)量×內(nèi)標(biāo)物峰面積）。

2 結(jié)果與分析

2.1 香味成分物質(zhì)分析

利用Nist11譜庫(kù)將質(zhì)譜圖中各色譜峰進(jìn)行檢索，同時(shí)進(jìn)行人工解析，對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。采用內(nèi)標(biāo)法（內(nèi)標(biāo)物0.821 1 mg/mL的乙酸苯乙酯）[假定相對(duì)校正因子（相對(duì)于內(nèi)標(biāo)）為1]對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量，結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4可以看出，煙草花蕾經(jīng)產(chǎn)香酵母發(fā)酵美拉德反應(yīng)加香后，經(jīng)GC-MS分析后共有香味物質(zhì)63種，主要包括醇18類、醛9類、酸10類、酯4類、酮10類、稀13類、呋喃、吡啶、吲哚、胺類等，其中軟脂酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、苯甲醇、苯乙醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮等香氣濃度大；巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香氣閾值低，是煙草中關(guān)鍵的致香物質(zhì)，對(duì)煙草香氣貢獻(xiàn)突出。

2.2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果

以氨基酸和還原糖含量為指標(biāo)優(yōu)化發(fā)酵條件，發(fā)酵條件正交試驗(yàn)每個(gè)樣品做3個(gè)水平的平行試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

從表5中可以看出，樣品6的氨基酸含量最高可達(dá)到2.860 52 mg/g，樣品8的還原糖含量最高可達(dá)到0.151 24 mg/g。樣品1的氨基酸含量最低，樣品5的還原糖含量最低。發(fā)酵處理的較優(yōu)水平為A2B2C2D2，A2′=A3′，B2′=B3′，C1′，D1′，主次因素為A>B>D>C、A′=B′=D′>C′。endprint

香氣總量是樣品4中含量最高，達(dá)到760.74 μg/g，樣品8的香氣總量最低，含量為385.30 μg/g，煙草花蕾香氣總量由高到低依次分別是樣品4、樣品7、樣品2、樣品3、樣品1、樣品5、樣品9、樣品6、樣品8。樣品6的氨基酸含量最高，樣品8的還原糖含量最高，但是樣品6、樣品8香氣總量都不是最高，樣品1的氨基酸含量最低，樣品5的還原糖含量最低，但是樣品1、樣品5香氣總量并不是最低。說(shuō)明香氣含量與氨基酸和還原糖含量的關(guān)系不是正相關(guān)關(guān)系。

3 小結(jié)

以煙草花蕾為原料，經(jīng)產(chǎn)香酵母的發(fā)酵處理，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵處理?xiàng)l件，然后產(chǎn)香酵母發(fā)酵正交優(yōu)化處理后進(jìn)行美拉德反應(yīng)，然后利用同時(shí)蒸餾萃取方法提取香味成分，GC-MS分析香味成分，得出發(fā)酵處理后經(jīng)美拉德反應(yīng)同時(shí)蒸餾萃取提取的香味物質(zhì)主要有63種，主要包括醇18類、醛9類、酸10類、酯4類、酮10類、稀13類、呋喃、吡啶、吲哚、胺類等，其中軟脂酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、苯乙醇、三環(huán)稀等香氣濃度大；巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香氣閾值低，是煙草中關(guān)鍵的致香物質(zhì)，對(duì)煙草香氣貢獻(xiàn)突出。產(chǎn)香酵母發(fā)酵正交試驗(yàn)及香氣總量結(jié)果可以看出，氨基酸含量最高可達(dá)到2.860 52 mg/g，還原糖含量最高可達(dá)到0.151 24 mg/g。但是氨基酸還原糖最高時(shí)，所對(duì)應(yīng)的香氣總量并非最高，說(shuō)明香氣含量與氨基酸和還原糖含量的關(guān)系不是正相關(guān)關(guān)系。

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