劉海軍，黃承俊

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300384；2.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)管理站,沈陽(yáng) 110032）

自從牛體外胚胎生產(chǎn)體系成功建立以來(lái)，人們?cè)噲D從不同的角度對(duì)這一體系進(jìn)行改進(jìn)，例如改變培養(yǎng)系統(tǒng)［1］，添加脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子［2-3］和 cAMP 調(diào)節(jié)因子［4］等，但和體內(nèi)胚胎相比牛體外胚胎的質(zhì)量仍然較差［5-6］，不僅囊胚細(xì)胞數(shù)較少而且移植妊娠率也不高。這使得人們認(rèn)識(shí)到提高牛胚胎質(zhì)量的必要性，因此胚胎質(zhì)量的檢驗(yàn)逐漸成為評(píng)估體外培養(yǎng)體系好壞的重要指標(biāo)之一。與傳統(tǒng)單一染色方法相比，雙重染色方法能清晰地將囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）和滋養(yǎng)層細(xì)胞（TE）區(qū)分開來(lái)，在評(píng)估上具有更高的準(zhǔn)確性。基于ICM與TE細(xì)胞免疫差異性的囊胚雙重染色［7］，已被人們成功地運(yùn)用于小鼠、牛、綿羊的囊胚上，在質(zhì)量的評(píng)估上取得了很好的效果［8-9］。鑒于免疫法較高的成本與較長(zhǎng)的處理時(shí)間，Thouas等［10］利用TritonX-100實(shí)現(xiàn)了囊胚雙重染色的簡(jiǎn)化，大大縮短了染色時(shí)間。然而這種基于TritonX-100對(duì)ICM與TE細(xì)胞膜通透性改變差異的染色，受胚胎質(zhì)量及處理程序的影響很大，往往同一處理程序在不同的實(shí)驗(yàn)有著巨大的差異，因而人們時(shí)常對(duì)TritonX-100的處理過(guò)程加以改進(jìn)以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)的需求［11］。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)中所用的化學(xué)試劑除特別說(shuō)明外，均購(gòu)自Sigma公司。

1.1 卵母細(xì)胞的采集

牛卵巢取自河北省大廠屠宰場(chǎng)。屠宰后卵巢置于37℃加有雙抗的生理鹽水中，2～3 h運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，除盡周圍脂肪組織，然后用加有雙抗的生理鹽水沖洗5～6次。抽吸法吸取直徑2～8 mm的卵泡，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求挑選裸卵、半裸卵及具有3層及其以上卵丘的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complexes，COCs）用于實(shí)驗(yàn)。

采卵液：TCM-199（Gibco）+5%胎牛血清（FBS，Gibco）+30 μg/mL 肝素鈉 +4.766 g/L Hepes。

1.2 體外成熟培養(yǎng)

將收集的卵母細(xì)胞用成熟液洗3遍，然后每40～60個(gè)移入平衡至少2 h的1 mL成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空氣、38.5℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23～24 h。若卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)則用微滴法（100 μL），以排出第一極體為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志。

成熟液：TCM-199+10%FBS+10 μg/mL FSH（寧波三生）+20 μg/mL LH（寧波三生）+1 μg/mL E2。

1.3 體外受精

受精液為IVF-100（Research Institute for the Functional Peptides，Yamagata，Japan），用直接離心法對(duì)精子洗滌。即用6 mL洗精液稀釋解凍的精液并于2 000 r/min下離心7 min，棄去上清液，重復(fù)一次后用受精液稀釋精子，密度為 1×106～6×106個(gè)/mL，然后放入 CO2培養(yǎng)箱中備用。IVF-100受精時(shí)間為6 h。

1.4 胚胎的體外培養(yǎng)

將經(jīng)體外受精的假定受精卵用胚胎培養(yǎng)液洗3遍，并用1 mL移液管部分或全部去除周圍的卵丘細(xì)胞。以10枚假定受精卵/100 μL微滴將假定受精卵隨機(jī)平等地移入平衡至少2h的微滴中進(jìn)行體外培養(yǎng)。從體外受精開始算起，第48小時(shí)對(duì)各組卵裂率進(jìn)行觀察與記錄，第7～9天對(duì)各組囊胚率進(jìn)行觀察與記錄，中途不換液。

1.5 囊胚細(xì)胞數(shù)染色及雙重染色

囊胚細(xì)胞數(shù)染色：將培養(yǎng)至7～9 d的牛囊胚去除卵丘細(xì)胞后放入含 10 μg/mL Hoechst33342（PBS）的染色液中染色 5 min，然后在 10%甘油（PBS）中浸泡 10～20 s，吸取少量的甘油和胚胎一起壓片并置于倒置熒光顯微鏡（型號(hào)：TE300，Nikon）紫外光下觀察照相。囊胚差異染色：將培養(yǎng)至7～9 d的牛囊胚按照不同的方法染色，壓片后置于倒置熒光顯微鏡紫外光下觀察照相。囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）細(xì)胞核呈藍(lán)色，滋養(yǎng)層（TE）細(xì)胞細(xì)胞核呈紅色，各組染色囊胚數(shù)至少3枚。

1.6 囊胚差異染色試驗(yàn)設(shè)計(jì)

方案一：對(duì)李瑞岐等［12］方法加以改進(jìn)。由于長(zhǎng)時(shí)間用0.5%鏈蛋白酶處理會(huì)導(dǎo)致囊胚的裂解，因而調(diào)整為55～60 s。用 PBS 洗 2～3 遍后于 10 μg/mL Hoechst33342中染色 5～10 min，然后移入 0.05%TritonX-100（PBS）中處理 60、50、30 和 18 s，于 PBS 中洗 2～3 遍后移入10 μg/mL PI、50 μg/mL PI中染色，每次根據(jù)上次染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，染色時(shí)間分 20 s、30 s、40 s、1 min、5 min、10 min。用PBS洗2～3遍后進(jìn)行壓片照相。

方案二：對(duì)李榮等［13］方法加以改進(jìn)。用0.5%鏈蛋白酶處理囊胚1 min后，于PBS中洗2～3遍，在0.5%TritonX-100中處理 20 s，于 PBS中洗 2～3遍后移入50 μg/mL PI、100 μg/mL PI中處理 30 s，用 PBS 洗 2～3遍后轉(zhuǎn)入 10 μg/mL Hoechst33342中染色 5 min和 15 min，用PBS洗2～3遍后壓片照相。

方案三：對(duì)Walker等［14］方法加以改進(jìn)。用0.5%鏈蛋白酶處理囊胚1 min后于PBS中洗2～3遍，100 μg/mL PI（0.5%TritonX-100/PBS）中染色 30 s，于 PBS 中洗 2～3遍后移入50 μg/mL Hoechst33342中染色15 min，用PBS洗2～3遍后壓片觀察；然后調(diào)整方法為用0.5%鏈蛋白酶處理囊胚1 min后于PBS中洗2～3遍，在10、20、50 μg/mL Hoechst33342 中染色 2～5 min，在 PBS 中洗 2～3遍后移入 100 μg/mL PI（0.5%TritonX-100/PBS）中染色30 s、20 s，用 PBS洗 2～3 遍后進(jìn)行壓片照相。

方案四：對(duì)Thouas等［10］方法加以改進(jìn)。用0.5%鏈蛋白酶處理囊胚 50～55 s后于 PBS中洗 2～3遍，在100 μg/mL PI（1%TritonX-100/PBS） 中染色 18～20 s，于PBS中洗2～3遍后移入45 μg/mL Hoechst33342中染色30～50 s，用 PBS洗 2～3 遍后壓片照相。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與分析。囊胚細(xì)胞總數(shù)用卡方（χ2）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 方案一牛囊胚雙重染色結(jié)果

去透明帶的牛囊胚在10 μg/mL Hoechst33342中染色30 min后，很大概率在隨后的處理過(guò)程中發(fā)生碎裂，因而實(shí)驗(yàn)中將Hoechst33342染色時(shí)間調(diào)整為5～10 min。按照李瑞岐等［12］的方法，對(duì) Hoechst33342、TritonX-100、PI不同濃度及處理時(shí)間的牛囊胚雙重染色結(jié)果見表1。用 Hoechst33342 處理 30 min、TritonX-100 處理 60 s、PI處理10 min，進(jìn)行染色時(shí)囊胚細(xì)胞幾乎全部染為紅色，染色結(jié)果見圖1C；調(diào)整TritonX-100處理時(shí)間為60 s、PI處理時(shí)間為1 min時(shí)囊胚細(xì)胞仍幾乎全部染為紅色，染色結(jié)果見圖1D；調(diào)整TritonX-100處理時(shí)間為30 s、PI處理時(shí)間為30 s時(shí)能將ICM細(xì)胞與TE細(xì)胞基本分別染上色，染色結(jié)果見圖1E；當(dāng)繼續(xù)降低TritonX-100處理時(shí)間為18 s、PI處理時(shí)間為20 s時(shí)表現(xiàn)為PI著色淺的現(xiàn)象，而且囊胚細(xì)胞多數(shù)為藍(lán)色，染色效果見圖1F。因而當(dāng)TritonX-100與PI處理時(shí)間都定為30s時(shí)，運(yùn)用此方法基本上能夠達(dá)到牛囊胚雙重染色的效果，由于每次重復(fù)照片都比較模糊，因而無(wú)法對(duì)ICM與TE進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 方案一不同染色結(jié)果

圖1 方案一囊胚差異染色效果

2.2 方案二牛囊胚雙重染色結(jié)果

去透明帶的囊胚是否再次孵化對(duì)染色的效果影響不大，因而本實(shí)驗(yàn)中將這一步驟去除。對(duì)Hoechst33342、TritonX-100、PI不同濃度及處理時(shí)間的牛囊胚雙重染色結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，PI濃度為50 μg/mL 和 100 μg/mL 時(shí)，囊胚細(xì)胞均染為藍(lán)色，見圖 2G；PI濃 度 為 100 μg/mL、Hoechst33342 染 色 時(shí)間降到5 min時(shí)，也只有少部分細(xì)胞染為紅色，見圖2H。所有染色未能將ICM細(xì)胞與TE細(xì)胞分別著色。

表2 方案二不同染色結(jié)果

圖2 方案二囊胚差異染色效果

2.3 方案三牛囊胚雙重染色結(jié)果

對(duì) Hoechst33342、TritonX-100、PI不同濃度及處理時(shí)間的牛囊胚雙重染色結(jié)果見表3。按照100 μg/mL PI中染色 30 s、50 μg/mL Hoechst33342 中染色 15 min 的方法進(jìn)行染色，囊胚細(xì)胞基本上全部染為藍(lán)色，染色結(jié)果見圖3I；調(diào)整染色方法為5 μg/mL Hoechst33342中染色 20 min、5 μg/mL PI中染色 20 s，基本上將 ICM 與TE細(xì)胞分別染為藍(lán)色與紅色，但染色效果不穩(wěn)定，見圖 3J；將 Hoechst33342 濃度調(diào)整為 20 μg/mL，染色時(shí)間調(diào)為5 min，5μg/mL PI中染色20 s，將ICM與TE細(xì)胞分別染為藍(lán)色與紅色，染色效果見圖3K。對(duì)調(diào)整后的方案進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表4。囊胚細(xì)胞總數(shù)與Hoechst33342染色結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05），ICM與囊胚細(xì)胞總數(shù)的比值為0.338 2，接近0.33。染色時(shí)間在5 min左右。說(shuō)明此改進(jìn)的方法基本上達(dá)到了牛囊胚快速雙重染色的目的。

表3 方案三不同染色結(jié)果

表4 方案三雙重染色效果

圖3 方案三囊胚差異染色效果

2.4 方案四牛囊胚雙重染色結(jié)果

對(duì) Hoechst33342、TritonX-100、PI不同濃度及處理時(shí)間的牛囊胚雙重染色結(jié)果見表5。將Thouas等［10］方法中4℃過(guò)夜步驟改為室溫下45 μg/mL Hoechst33342中染色30～50 s，染色結(jié)果見圖4L，ICM細(xì)胞染為藍(lán)色，TE細(xì)胞染為紅色，界限較為明顯。對(duì)染色后數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表6。囊胚細(xì)胞總數(shù)有高于Hoechst33342染色的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。ICM與囊胚細(xì)胞總數(shù)的比值0.335 6，接近0.33。染色時(shí)間在3 min左右。說(shuō)明此改進(jìn)方法基本上達(dá)到了牛囊胚快速雙重染色的目的。

表5 方案四不同染色結(jié)果

表6 方案四雙重染色效果

圖4 方案四囊胚差異染色效果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在4個(gè)改進(jìn)的方案中有3個(gè)方案基本上能夠?qū)CM與TE分別著色，但只有改進(jìn)的方案三、方案四能夠達(dá)到快速雙重染色的目的，其中改進(jìn)的方案四效果最好，也最為穩(wěn)定。運(yùn)用低濃度的TritonX-100對(duì)囊胚進(jìn)行短時(shí)處理，能夠在不破壞ICM細(xì)胞膜的情況下增加TE細(xì)胞的通透性，使得分子量較大的紅色熒光染料PI可通過(guò)TE細(xì)胞膜對(duì)其進(jìn)行染色，從而達(dá)到囊胚雙重染色的效果。對(duì)于Hoechst33342著色的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞膜通透性增大時(shí)，PI很容易對(duì)其進(jìn)行復(fù)染，并顯示為紅色；而對(duì)于PI著色的細(xì)胞，低濃度的Hoechst33342則需要較長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行復(fù)染，并且細(xì)胞顏色由紅色逐漸變化為藍(lán)色。這表明不管是先用Hoechst33342染色還是先用PI染色，膜通透性大的細(xì)胞都將顯示為紅色，最終兩者染色的效果都是一樣的，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)方案三和方案四中ICM/囊胚細(xì)胞總數(shù)的對(duì)比（33.82 VS 33.56）也證實(shí)了這一點(diǎn)。

隨著囊胚的不斷發(fā)育，細(xì)胞數(shù)量也在不斷增加，所需TritonX-100處理的時(shí)間也相應(yīng)增加［15］。在方案一中李瑞岐等［12］的方法是用于第8天牛擴(kuò)囊或孵化囊胚，而本實(shí)驗(yàn)中所染色的胚胎為標(biāo)準(zhǔn)囊胚，在細(xì)胞數(shù)上要少于擴(kuò)囊與孵化囊胚很多，因而TritonX-100處理60～69 s已不再適用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在牛標(biāo)準(zhǔn)囊胚上運(yùn)用李瑞岐等［12］囊胚雙重染色方法時(shí)，TritonX-100的處理時(shí)間在30 s是可行的。同時(shí)建議0.5%鏈蛋白酶處理時(shí)間調(diào)整為 1 min，Hoechst33342處理時(shí)間調(diào)整到 2～10 min，PI處理時(shí)間縮短到30 s左右。因?yàn)榕Ｄ遗咴?.5%鏈蛋白酶中處理1 min左右透明帶就基本上被去除了，如果處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不僅會(huì)影響到ICM細(xì)胞膜的通透性，還會(huì)使細(xì)胞間的連接變得太松散，在接下來(lái)的處理過(guò)程中會(huì)增強(qiáng)TritonX-100對(duì)ICM細(xì)胞膜通透性的改變，而且胚胎還容易散裂。

在改進(jìn)的方案四中顯示，Hoechst33342室溫短時(shí)處理也能達(dá)到牛囊胚雙重染色的目的，而且這種方法大大縮短了染色時(shí)間，提高了評(píng)估囊胚質(zhì)量的效率。李榮等［15］的染色方法和 Walker 等［14］的方法與 Thouas 等［10］的染色方法相似，都是通過(guò)先改變細(xì)胞膜的通透性對(duì)TE細(xì)胞進(jìn)行染色，再對(duì)ICM細(xì)胞進(jìn)行著色，然而本實(shí)驗(yàn)并未在原有方法的基礎(chǔ)上成功對(duì)牛囊胚進(jìn)行雙重染色，這有可能與胚胎階段及所重復(fù)的次數(shù)有關(guān)。然而對(duì)方法三改進(jìn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，先進(jìn)行ICM細(xì)胞的染色，再對(duì)TE細(xì)胞著色也能夠達(dá)到牛囊胚雙重染色的目的，這反過(guò)來(lái)也說(shuō)明了改進(jìn)的方案一是可行的。囊胚簡(jiǎn)易差異染色對(duì)胚胎時(shí)期的一致性要求很高，因而在染色過(guò)程中要特別注意。總體而言，改進(jìn)的方案三、方案四效果最好、時(shí)間最短，達(dá)到了快速檢測(cè)的目的。運(yùn)用改良的Walker等［14］的方法能夠?qū)蝹€(gè)胚胎染色時(shí)間降到5 min，但效果不如改良的Thouas［10］等的方法好。運(yùn)用改良的Thouas等［10］的方法能夠?qū)蝹€(gè)胚胎染色時(shí)間降到3 min。

4 小結(jié)

改進(jìn)的方案四染色最為穩(wěn)定，效果較好，整個(gè)染色時(shí)間由原來(lái)的12 h（過(guò)夜）降到不到3 min，極大地提高了染色效率，可以作為一種快速、簡(jiǎn)潔、有效的牛囊胚質(zhì)量的鑒別方法。

［1］Al Darwich A，Perreau C，Tsikis G，et al.Effect of different culture systems on adipocyte differentiation-related protein （ADRP） in bovine embryos［J］.Animal Reproduction Science，2014，145（3）：105-113.

［2］Ruiz A，Hansen P J，Block J.Effects of lipidmetabolic regulators during bovine embryo culture on blastocyt development and cryosurvival［J］.Reproduction，F(xiàn)ertility and Development，2014，26（1）：138.

［3］Stinshoff H，Wilkening S，Hanstedt A，et al.Dimethylsulfoxide and conjugated linoleic acids affect bovine embryo developmentin vitro［J］.Reproduction，F(xiàn)ertility and Development，2014，26（4）：502-510.

［4］Ulloa S M，Heinzmann J，Herrmann D，et al.Effects of different oocyte retrieval andin vitromaturation systems on bovine embryo development and quality［J］.Zygote，2015，23（3）：367-377.

［5］Ushijima H，Akiyama K，Tajima T.Transition of cell numbers in bovine preimplantation embryos：in vivocollected andin vitroproduced embryos ［J］.Journal of Reproduction and Development，2008，54（4）：239-243.

［6］Pontes J H F，Nonato-Junior I，Sanches B V，et al.Comparison of embryo yield and pregnancy rate betweenin vivo and in vitromethods in the same Nelore（Bos indicus）donor cows［J］.Theriogenology，2009，71（4）：690-697.

［7］Handyside A H，Hunter S.A rapid procedure for visualising the inner cell mass and trophectoderm nuclei of mouse blastocysts in situ using polynucleotide-specific fluorochromes［J］.Journal of Experimental Zoology，1984，231（3）：429-434.

［8］蘆天罡，郭勇，倪和民，等.一種鑒定小鼠胚胎質(zhì)量的雙重?zé)晒馊旧椒ǎ跩］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，54（5）：928-932.

［9］Park S B，Kim H J，Choi Y B，et al.The effect of various assisted hatching techniques on the mouse early embryo development［J］.Clinical and Experimental Reproductive Medicine，2014，41（2）：68-74.

［10］Thouas G A，Korfiatis N A，F(xiàn)rench A J，et al.Simplified technique for differential staining of inner cell mass and trophectoderm cells of mouse and bovine blastocysts［J］.Reproductive Biomedicine Online，2001，3（1）：25-29.

［11］萬(wàn)鵬程，石文艷，周平，等.綿羊體外受精胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)化與囊胚差異染色［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（12）：2469-2476.

［12］李瑞岐，桑潤(rùn)滋.以囊胚雙重染色方法檢驗(yàn)果糖對(duì)牛胚胎早期發(fā)育效果的影響［J］.中國(guó)畜牧雜志，2010（9）：23-25.

［13］李榮，劉穎，趙興波，等.無(wú)血清培養(yǎng)基IVD101和G1/G2在牛體細(xì)胞核移植中的應(yīng)用研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（11）：1487-1492.

［14］Walker D J，Seidel Jr G E.Vitrofication of bovine embryos in medium with polyvinyl alcohol replacing BSA［J］.Reproduction，F(xiàn)ertility and Development，2005，18（2）：165.

［15］李瑞岐，王文軍，歐陽(yáng)能勇，等.小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞的雙重染色方法［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2012，33（14）：2058-2060.