李慧珍,牛丕業(yè),陳 麗,宋冬梅,張媛媛,馬俊香

(首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100069;*通訊作者,E-mail:majxiang83@ccmu.edu.cn)

帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,主要癥狀是震顫,僵硬,運(yùn)動(dòng)遲緩,步態(tài)異常。主要病理改變是黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)元退行性變和被稱(chēng)為路易氏小體(Lewy body,LB)的細(xì)胞包含物的形成,黑質(zhì)神經(jīng)元減少和不同程度的膠質(zhì)細(xì)胞增生。研究顯示,90%以上的PD患者的致病因素都與環(huán)境污染物密切相關(guān),其中殺蟲(chóng)劑魚(yú)藤酮接觸尤為明顯。

魚(yú)藤酮是一種植物性殺蟲(chóng)劑,屬于異黃酮家族的一員,主要存在于醉魚(yú)豆屬植物毛魚(yú)藤的植物根莖,研究表明,用魚(yú)藤酮染毒可誘發(fā)動(dòng)物出現(xiàn)類(lèi)似PD的典型臨床癥狀:運(yùn)動(dòng)遲緩、僵直、震顫;用魚(yú)藤染毒小鼠在黑質(zhì)紋狀體的細(xì)胞中也可出現(xiàn)α突觸蛋白(α-synuclein)聚集和DA神經(jīng)元的丟失現(xiàn)象[1],而α-synuclein的異常堆積是LB的主要組成成分。這些研究提示魚(yú)藤酮可通過(guò)引起α-synuclein沉積或聚集和黑質(zhì)DA神經(jīng)元的丟失,進(jìn)而導(dǎo)致PD疾病的發(fā)生,但具體機(jī)制尚不清楚。本文從魚(yú)藤酮的理化性質(zhì)、毒性作用及其導(dǎo)致PD的可能機(jī)制進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述,為PD的治療提供理論參考。

1 魚(yú)藤酮的理化性質(zhì)及其毒性作用

魚(yú)藤酮是一種殺蟲(chóng)劑,又被稱(chēng)為毒魚(yú)藤,分子式為C23H22O6,無(wú)色六角板狀晶體,存在于魚(yú)藤屬植物根皮部,脂溶性很強(qiáng)。難溶于水,易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑?？梢圆唤柚魏屋d體蛋白直接穿透血腦屏障和細(xì)胞膜。其主要生物學(xué)效應(yīng)是抑制細(xì)胞呼吸鏈NADH脫氫酶(即復(fù)合物I,complex I)的活性,影響細(xì)胞呼吸鏈對(duì)氧的利用,造成細(xì)胞內(nèi)呼吸抑制性缺氧。

2 魚(yú)藤酮導(dǎo)致帕金森病的機(jī)制

PD患者的一個(gè)顯著病理特點(diǎn)是在黑質(zhì)和其他腦干內(nèi)存在LB。α-synuclein的異常積累是LB的主要成分,也是直接導(dǎo)致DA神經(jīng)元變性壞死的主要原因,但α-synuclein在細(xì)胞質(zhì)中的異常聚集機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞降解途徑如自噬的異常,可能使細(xì)胞更容易形成因α-synuclein的異常積累或其他未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集而引起的蛋白質(zhì)聚集體。自噬在PD中的作用仍存在爭(zhēng)議,自噬功能的異常與α-synuclein的聚集和毒性的關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究[2]。在星形膠質(zhì)細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)α-synuclein可以促進(jìn)細(xì)胞自噬抑制和細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)藤酮、百草枯等多種殺蟲(chóng)劑都可以直接和α-synuclein作用,促進(jìn)其聚集[1],但具體機(jī)制不清。此外,研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)藤酮可能通過(guò)神經(jīng)炎癥而引發(fā)PD發(fā)病[3,4]。因此本文將從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬和神經(jīng)炎癥反應(yīng)三個(gè)方面介紹魚(yú)藤酮致PD的可能機(jī)制。

2.1 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是神經(jīng)元細(xì)胞退變或丟失的主要途徑之一。細(xì)胞凋亡又稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡,是多細(xì)胞生物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中調(diào)控機(jī)體發(fā)育,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)的主動(dòng)死亡的過(guò)程。魚(yú)藤酮是一種細(xì)胞毒性物質(zhì),可選擇性地阻斷線粒體呼吸鏈復(fù)合物I,使呼吸鏈不能將NADH氧化為NAD、生成的ATP減少,質(zhì)子傳遞障礙,進(jìn)而增加細(xì)胞中活性氧的含量,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和自由基形成[5],自由基含量的升高可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。魚(yú)藤酮可以通過(guò)直接和間接兩種方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡。用魚(yú)藤酮處理PC12細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤酮可通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)氧化氫酶表達(dá),增加細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,阻斷mTOR介導(dǎo)的S6K-1和4E-BP1/eIF4E通路,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6]。研究發(fā)現(xiàn),降低細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶的含量可以抑制魚(yú)藤酮引起的細(xì)胞凋亡,提示H2O2參與了細(xì)胞凋亡。魚(yú)藤酮也可能通過(guò)提高ROS含量,促進(jìn)鈣離子內(nèi)流間接地促進(jìn)細(xì)胞凋亡。褪黑素可以阻止與氧化應(yīng)激相關(guān)的DA神經(jīng)元變性[7],Swamkar等[8]發(fā)現(xiàn)褪黑素雖然可以清除ROS,卻不能阻斷魚(yú)藤酮引起的細(xì)胞核和DNA的損傷,因此魚(yú)藤酮也可能通過(guò)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,進(jìn)而提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度,從而引起細(xì)胞凋亡。除了ROS和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,魚(yú)藤酮可能通過(guò)減少ATP的生成降低線粒體膜電位(ΔΨm),改變膜的通透性,位于線粒體膜間隙的細(xì)胞色素c進(jìn)入胞漿[9,10],從而引發(fā)細(xì)胞的凋亡通路。綜上所述,細(xì)胞內(nèi)ROS、鈣離子濃度增高、ΔΨm改變?cè)隰~(yú)藤酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的作用。

2.2 細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬(autophagy)是生物體內(nèi)清除功能異常的細(xì)胞器、被氧化的脂類(lèi)、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)等有害大分子物質(zhì)的重要途徑,越來(lái)越多的研究表明自噬失調(diào)可能與神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森癥(Parkinson’s disease,PD)等相關(guān)[5,6]。被氧化的脂類(lèi)、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)等若不能被及時(shí)有效地清除,就會(huì)造成積聚,可引起神經(jīng)細(xì)胞功能喪失、乃至死亡,是導(dǎo)致神經(jīng)退行性變的主要原因[7]。根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體的方式不同將自噬方式分為三種：大自噬(macroautophagy),小自噬(microautophagy),分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)[11]。大自噬是最主要的自噬方式,主要是由雙層膜包裹被部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器,蛋白質(zhì)等物質(zhì)形成自噬體,運(yùn)輸?shù)饺苊阁w被降解。大自噬中有一種特殊方式的自噬方式即為線粒體自噬。小自噬是不形成自噬體,溶酶體膜內(nèi)陷,被降解物直接被溶酶體降解。CMA降解特定的蛋白質(zhì),最終也是在溶酶體內(nèi)完成降解[11-13]。

2.2.1 分子伴侶自噬與大自噬 魚(yú)藤酮通過(guò)阻斷α-synuclein的降解途徑使α-synuclein聚集[14]。野生型α-synuclein的降解主要通過(guò)CMA途徑或者大自噬途徑[15],當(dāng)這兩種降解途徑被阻斷時(shí),α-synuclein就會(huì)聚集。魚(yú)藤酮可以通過(guò)影響上述兩種途徑導(dǎo)致帕金森病的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)藤酮可以通過(guò)降低Hsc70表達(dá)程度阻斷CMA過(guò)程[16],Hsc70參與CMA降解蛋白質(zhì)的過(guò)程,但魚(yú)藤酮導(dǎo)致Hsc70水平下降的機(jī)制尚不清楚?？赡芘c線粒體功能受抑制有關(guān)。其次發(fā)現(xiàn),提高自噬水平可以緩解魚(yú)藤酮導(dǎo)致的PD癥狀[17-19],證明自噬參與了帕金森的發(fā)病過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)被魚(yú)藤酮處理過(guò)的PC12細(xì)胞中與細(xì)胞自噬有關(guān)的蛋白質(zhì)LC3和p62水平都有所上升[19,20],LC3通常用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的自噬水平。LC3升高表明自噬水平提高,p62作為自噬的底物通常用來(lái)檢驗(yàn)自噬流的完整性,p62含量升高說(shuō)明自噬流的不完整性[21],自噬流不完整使α-synuclein的降解受限,同時(shí)α-synuclein聚集反過(guò)來(lái)也會(huì)阻斷自噬流形成惡性循環(huán)嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常功能,最終DA神經(jīng)元受損導(dǎo)致帕金森病的發(fā)生。

雖然自噬流被阻斷可以很好地解釋DA神經(jīng)元損傷,但也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p62含量降低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬水平的提高是有時(shí)間依存性的,處理前期自噬水平提高,后期自噬水平有所下降同時(shí)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡[22]。出現(xiàn)結(jié)果差異的原因可能是檢測(cè)時(shí)間不同,用魚(yú)藤酮處理前期α-synuclein開(kāi)始堆積,細(xì)胞通過(guò)提高自噬水平來(lái)降解堆積的蛋白質(zhì)維持細(xì)胞正常水平,LC3升高,p62的含量下降,隨著時(shí)間的增長(zhǎng)α-synuclein的堆積超過(guò)細(xì)胞的負(fù)荷,凋亡程序被啟動(dòng),因此提高自噬水平的預(yù)處理可以減輕魚(yú)藤酮對(duì)細(xì)胞的損傷[23]。魚(yú)藤酮損傷自噬過(guò)程可能與線粒體損傷,膜通透性改變導(dǎo)致胞漿Ca2+升高有關(guān)[14],有文獻(xiàn)證明鈣離子參與了自噬的調(diào)節(jié)過(guò)程[24]。

2.2.2 線粒體自噬 在上述魚(yú)藤酮的理化性質(zhì)及其毒性作用中已經(jīng)提到,魚(yú)藤酮可抑制細(xì)胞呼吸鏈complex I的活性,減少ATP的生成,降低ΔΨm,增加線粒體膜的通透性[9],損傷線粒體,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和線粒體自噬的發(fā)生[25]。線粒體自噬是大自噬的一種,能及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體進(jìn)而維持細(xì)胞的正常功能。魚(yú)藤酮誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生的機(jī)制有Parkin途徑和非Parkin途徑,非Parkin途徑是指研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤酮可通過(guò)誘導(dǎo)心磷脂(CL)從線粒體內(nèi)膜到線粒體外膜的轉(zhuǎn)位同時(shí)LC3在線粒體外膜上與CL結(jié)合,導(dǎo)致線粒體自噬的發(fā)生。CL是線粒體內(nèi)膜上的特有脂類(lèi),在穩(wěn)定線粒體呼吸鏈復(fù)合物和線粒體嵴的作用方面發(fā)揮重要的作用,CL和LC3結(jié)合在線粒體自噬中發(fā)揮重要作用[26]。用RNAi降低CL,可降低魚(yú)藤酮毒染的細(xì)胞中線粒體自噬水平。有趣的是,在魚(yú)藤酮處理的細(xì)胞中p62、Parkin和PINK1含量并無(wú)明顯變化,提示魚(yú)藤酮可能不是通過(guò)Parkin途徑誘導(dǎo)線粒體自噬[27]。但Alvin等[28]也發(fā)現(xiàn)在魚(yú)藤酮處理的小鼠神經(jīng)細(xì)胞中Parkin途徑相關(guān)的線粒體自噬途徑被激活,ROS含量升高在Parkin途徑的激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用。綜上所述,在魚(yú)藤酮致PD過(guò)程中,線粒體自噬可能發(fā)揮著重要的作用,但激活線粒體自噬的途徑尚存在爭(zhēng)議,可能是與細(xì)胞種類(lèi)、觀測(cè)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)條件等因素有關(guān),因此,在魚(yú)藤酮致PD過(guò)程中,線粒體自噬的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步深入的探討。

2.2.3 溶酶體功能紊亂 不管是CMA、大自噬,還是線粒體自噬,三者的最終通路都是在溶酶體內(nèi)完成,因此,溶酶體的正常功能對(duì)維持自噬的正常水平具有很重要的意義。魚(yú)藤酮不僅可以通過(guò)提高胞質(zhì)Ga2+含量阻斷自噬流,還可通過(guò)損傷溶酶體阻斷自噬。這種損傷作用與ROS含量升高有關(guān),ROS能增加溶酶體膜通透性[27],引起細(xì)胞凋亡蛋白酶(cathepsins)的釋放和激活,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)cathepsinD從溶酶體到細(xì)胞液的重新分布[4],溶酶體中cathepsinD含量減少說(shuō)明其儲(chǔ)存功能下降,溶酶體功能障礙會(huì)阻斷自噬流[29]。另外還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤酮可以通過(guò)提高自噬小泡的pH值阻斷自噬流。這可能與ATP生成量減少,依賴(lài)ATP的酸化過(guò)程受到抑制有關(guān)。

2.3 神經(jīng)炎癥反應(yīng)

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥在PD發(fā)病機(jī)制中起著很重要的作用。魚(yú)藤酮可通過(guò)MAPK通路直接激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[30]。小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞,約占成熟大腦膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的10%-15%,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能釋放多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β,這些炎癥因子能直接或間接損傷神經(jīng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤酮能活化激酶MAPK,引起轉(zhuǎn)錄因子NF-κB從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位。可能的機(jī)制是:魚(yú)藤酮提高活性氧水平,活性氧活化MAPK[31],從而激活NF-κB通路,進(jìn)而激活小膠質(zhì)細(xì)胞[32]。而Heather等[33]卻發(fā)現(xiàn)在LPS(脂多糖)和魚(yú)藤酮處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中,用LPS處理的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了TNF-α、IL-1β水平升高、小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變等現(xiàn)象,但用魚(yú)藤酮處理的實(shí)驗(yàn)組并沒(méi)有出現(xiàn)上述炎癥因子增多等現(xiàn)象,提示魚(yú)藤酮可能不能直接活化小膠質(zhì)細(xì)胞,該觀點(diǎn)在Gao等[34]的研究中也得到了證實(shí)。對(duì)于上述兩種截然不同的結(jié)論目前尚沒(méi)有一個(gè)合理的解釋[35]。

3 展望

綜上所述,魚(yú)藤酮可能主要從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、神經(jīng)炎癥反應(yīng)方面導(dǎo)致PD的發(fā)生,但目前關(guān)于魚(yú)藤酮導(dǎo)致PD的發(fā)病機(jī)制還不是十分清晰,了解該機(jī)制對(duì)治療魚(yú)藤酮導(dǎo)致的DA神經(jīng)元損傷和丟失具有十分重要的意義,同時(shí)越來(lái)越多的研究表明自噬和神經(jīng)炎癥參與了帕金森發(fā)病過(guò)程,因此,如何特異性地提高神經(jīng)細(xì)胞的自噬能力和抑制神經(jīng)炎癥,為有效治療PD提供可能的方向。