劉生峰， 楊 俊， 陸麗華

(重慶出入境檢驗檢疫局，重慶 400020)

食品微生物檢驗是食品衛(wèi)生安全評價的重要技術(shù)手段之一。近年來，隨著我國國民經(jīng)濟的迅猛發(fā)展以及社會主義精神文明建設(shè)的不斷提高，食品安全愈來愈受到社會的廣泛關(guān)注，食品微生物檢驗在服務(wù)社會公眾及政府職能部門對食品安全進行評價及質(zhì)量監(jiān)管方面發(fā)揮著重要作用。然而，食品微生物檢驗技術(shù)的現(xiàn)狀并不令人滿意，檢驗操作繁瑣、檢驗周期長、檢驗工作效率低等問題一直是困擾食品微生物檢驗工作的技術(shù)瓶頸,與當前社會的發(fā)展需求有著較大的差距。因此，如何發(fā)展快速、高效、準確的微生物檢驗新技術(shù)和方法，滿足社會經(jīng)濟發(fā)展需求，是食品微生物檢驗工作的當務(wù)之急[1-2]。

1 食品微生物檢驗技術(shù)現(xiàn)狀

長期以來，食品微生物檢驗一直遵循增菌培養(yǎng)、分離純化、形態(tài)學(xué)及生化、血清學(xué)鑒定這樣的傳統(tǒng)方法。傳統(tǒng)方法具有準確可靠的特點，但卻存在檢驗周期長、檢驗操作繁瑣、效率不高的問題。如增菌培養(yǎng)、分離純化、生化鑒定等步驟通常都分別需要1 d以上的培養(yǎng)時間；平板分離的挑菌落步驟，需要有一定工作經(jīng)驗的檢驗人員才能勝任；鑒定一個對象菌需要做多個生化試驗才能完成等[3]。2003年以前我國發(fā)布的食品微生物檢驗國家標準(GB 4789標準系列)幾乎都是采用上述傳統(tǒng)檢驗方法。直到2008年以后發(fā)布的國家標準中才開始逐漸引入了一些新的檢測技術(shù)和方法。如：GB4789.4-2010食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗；GB/T 4789.36-2008 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗等國家標準中就引入儀器自動化生化鑒定方法、免疫磁珠捕獲法、全自動酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法、全自動病原菌檢測系統(tǒng)篩選法等新技術(shù)方法。國家質(zhì)檢總局近年來發(fā)布的出入境檢驗檢疫行業(yè)標準中，也有引入PCR檢測方法、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)檢測方法、基因芯片法等一些新的檢驗技術(shù)方法。如SN/T2525-2010食品中肉毒梭菌的PCR檢測方法；SN/T2754-2011出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)檢測方法系列標準；SN/T2651-2010肉及肉制品中常見致病菌檢測方法 基因芯片法等。

2 微生物檢驗技術(shù)的新進展

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、儀器自動化分析技術(shù)等各種生物分析技術(shù)的快速發(fā)展，食品微生物檢驗技術(shù)也有了新突破，出現(xiàn)了許多新的檢測技術(shù)和方法。

2.1 基于傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)上的改進

對一些培養(yǎng)基成分進行改良，提高培養(yǎng)基的特異性增菌或分離效果，如：沙門氏菌、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基；對培養(yǎng)基的使用便利性進行改進，如快速檢測紙片、集成化的生化鑒定試劑條及儀器自動化技術(shù)。將傳統(tǒng)檢驗中比較繁瑣的實驗操作通過儀器自動化完成，如：生物梅里埃的VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)[4-5]，即是通過儀器自動化完成微生物的生化鑒定及結(jié)果分析工作。

2.2 免疫學(xué)快速篩選方法

由于免疫學(xué)反應(yīng)的快速、靈敏、特異性等特點，可以將其用于目標微生物的快速篩選[6]。如：大腸埃希菌O157∶H7的乳膠凝集試驗、沙門氏菌的膠體金快速檢測試劑條等。這類方法可以對目標微生物進行簡單的快速篩選。免疫磁珠捕獲法則是通過免疫磁珠對目標微生物的富集，提高傳統(tǒng)方法的敏感性[7]。全自動酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法則是將微生物的免疫學(xué)篩選由儀器自動化完成。

2.3 基于核酸擴增的分子診測技術(shù)

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基于核酸擴增的各種微生物檢測新技術(shù)和新方法不斷涌現(xiàn)。出現(xiàn)最多的是PCR方法和熒光定量PCR方法[8-9]。此外還有基于等溫擴增技術(shù)的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)方法[10]、NASBA方法[11]等。這類方法首先都需要對目標微生物的核酸保守序列進行分析，設(shè)計特異性引物，建立核酸擴增體系。通過擴增體系中引物對目標微生物特征核酸片段的快速擴增，使目標微生物的特征核酸片段數(shù)量迅速放大，進而能夠檢測到擴增的目標核酸片段。其優(yōu)點是能在短時間內(nèi)將目標微生物的特征核酸片段數(shù)量擴增放大，從而達到快速篩選目標微生物的目的。

此后，在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上又發(fā)展了多重PCR技術(shù)。即：針對多個目標微生物的核酸序列設(shè)計多對引物，對多個目標微生物的核酸片段同時進行擴增，擴增結(jié)果可通過瓊脂糖凝膠電泳、毛細管電泳、基因芯片雜交等技術(shù)進行結(jié)果分析，進而發(fā)展出一些多項目并行檢測的高通量檢測方法。如Shin等[12]基于細菌的16S rRNA設(shè)計寡核苷酸探針建立了可同步建成食品中16種致病菌的基因芯片檢測方法；肖進文等[13]針對肉及肉制品中沙門氏菌等5種致病菌建立的基因芯片方法等。多重PCR技術(shù)具有節(jié)約成本、檢測效率高的特點，一次能擴增多個目的基因片段。但該技術(shù)隨著引物對數(shù)的增多，擴增體系的條件摸索較復(fù)雜，容易出現(xiàn)多重PCR擴增過程中各對引物擴增效率不均以及非特異性擴增等問題。于是有人開始研究對多重PCR技術(shù)的改進方法,Zhou等[14]針對食品中6種致病菌建立的GeXP(GenomeLab Gene Expression Profiler)多重基因分析方法(圖1)是一種新型的多重PCR結(jié)合毛細管電泳分析的高通量分析方法。該法在設(shè)計引物時，設(shè)計一對通用引物，并在特異性引物一端加上一段能被通用引物識別的標簽序列。多重PCR過程分兩個階段完成：初始階段由特異性引物對目標基因進行特異性擴增，第二階段則是由通用引物對初始擴增產(chǎn)物進行二次擴增。初期擴增是在低濃度下的特異性擴增，各引物間的擴增效率不易受到影響。第二階段擴增由一對通用引物引導(dǎo)，與一對引物的PCR擴增體類似。擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳系統(tǒng)分析。該法較好地解決了多重PCR擴增過程中各對引物擴增效率不均的難題。對6種目標菌的靶序列同時進行多重PCR擴增，能達到滿意的擴增結(jié)果。Villamizar-RG等[15]則是把多重PCR和毛細管電泳技術(shù)結(jié)合，建立一種經(jīng)過通用方法前增菌富集后可同步檢測9種致病菌的高效靈敏檢測方法。

此外，錢雪峰等[16]利用Tem-PCR結(jié)合Luminex技術(shù)建立了對葡萄球菌及其耐藥基因進行快速檢測的高通量檢測方法。Tem-PCR技術(shù)跟GeXP技術(shù)類似，設(shè)計待擴增的每一種靶序列的特異性引物，增加一對超級引物，特異性引物中帶有能被超級引物識別的標簽序列。擴增過程分三個階段：富集階段、加標階段和擴增階段。富集和加標階段是低濃度下，特異性異物對靶標序列的特異性擴增；擴增階段是高濃度的超級引物對特異性擴增產(chǎn)物的大批量擴增。該法能同時對葡萄球菌的18種分子標靶序列進行擴增。Tem-PCR擴增結(jié)果通過Luminex液相芯片技術(shù)進行檢測。

2.4 其他新興的微生物檢測技術(shù)和方法

脈沖場電泳技術(shù)鑒定微生物，則是另一種基于核酸分子的微生物分型鑒定技術(shù)。如：范放等[17]利用脈沖場電泳技術(shù)對進出口食品中的腸炎沙門氏菌進行分子分型分析，建立了腸炎沙門氏菌的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。該法通過限制性內(nèi)切酶對核酸分子進行切割，用脈沖場電泳系統(tǒng)對酶切后的核酸片段進行分離，得到不同大小核酸片段的脈沖場電泳條帶。在相同條件下，同種微生物核酸分子形成的脈沖場電泳條帶是相同的，不同微生物核酸分子形成的脈沖場電泳條帶不同。據(jù)此，可用已知微生物建立DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，將待檢菌核酸分子的脈沖場電泳條帶與數(shù)據(jù)庫中已知菌的脈沖場電泳條帶比對，從而達到鑒定微生物的目的。

圖2 MALDI-TOF MS技術(shù)原理Fig.2 Principle of MALDI-TOF MS

此外，由生物梅里埃公司等推出的MALDI-TOF MS(圖2)微生物基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜分析方法(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry)，是微生物分析的又一種全新技術(shù)。該法以飛行時間質(zhì)譜技術(shù)為核心，微生物細胞在特定條件下裂解、離子化，形成若干分子量大小不同的離子碎片，離子碎片在真空飛行管中自由飛行，分子量越小，飛行速度越快，越先到達飛行管末端，而位于飛行管末端的檢測器就能依次檢測到不同質(zhì)量碎片到達的信號，從而得到細胞裂解碎片的質(zhì)譜圖。同一種微生物細胞在相同裂解條件下，得到的飛行質(zhì)譜圖是相同的；不同微生物細胞裂解所得到的飛行質(zhì)譜圖不相同。據(jù)此，可以首先用已知的標準菌株細胞經(jīng)時間飛行質(zhì)譜進行分析，得到該菌株的特征質(zhì)譜圖，建立標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。將待檢菌株通過飛行質(zhì)譜進行檢測，得到待檢菌株的質(zhì)譜圖，待檢菌株的質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中的標準質(zhì)譜圖進行比對，得出鑒定結(jié)果[18]。該法能夠在數(shù)十分鐘內(nèi)對細菌、真菌等進行快速鑒定，是目前最高效的微生物儀器鑒定方法之一。

微生物學(xué)與其他學(xué)科相結(jié)合，如生物傳感器技術(shù)[19]、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光技術(shù)等的結(jié)合也誕生出一些新型的檢測方法。如Sharp等[20]報道了利用噬菌體介導(dǎo)生物發(fā)光技術(shù)檢測食品中炭疽桿菌的快速檢測方法。

圖3 流式細胞計數(shù)原理Fig.3 Principle of Flow Cytometry

在微生物的計數(shù)檢測方面也有一些新技術(shù)出現(xiàn)。如碧迪公司的BD FACS MicroCount全自動微生物計數(shù)分析儀直接計數(shù)法(圖3)。該法將流式細胞計數(shù)技術(shù)和熒光染色技術(shù)結(jié)合，對樣本中的活菌、死菌直接進行計數(shù)。數(shù)分鐘內(nèi)就能得到直接計數(shù)結(jié)果。與傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法至少需要1 d以上培養(yǎng)時間相比，其效率有了質(zhì)的飛躍。

3 展 望

隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)和儀器分析技術(shù)的飛速發(fā)展，為食品微生物檢測技術(shù)的發(fā)展帶來了新的契機。以傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)為基礎(chǔ)的儀器自動化技術(shù)日趨成熟，將愈來愈多地應(yīng)用到日常檢驗工作中?；诤怂釘U增的PCR方法、熒光定量PCR方法以及環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)方法等技術(shù)，因其快速、靈敏的特點，將會在食品微生物檢驗工作中得到進一步的發(fā)展。基因芯片技術(shù)、GeXP技術(shù)、Tem-PCR技術(shù)、Luminex液相芯片技術(shù)等多項目并行檢測技術(shù)，是大批量樣本檢測工作中更加快速、高效的高通量檢測方法，值得進一步探索和發(fā)展。DNA指紋分析技術(shù)是在分子水平上對微生物進行分型鑒定的一種新嘗試。MALDI-TOF MS飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)，能夠大幅度提升微生物鑒定的工作效率，是一種全新高效的微生物快速鑒定技術(shù)?；诹魇郊毎嫈?shù)技術(shù)和熒光染色技術(shù)結(jié)合的微生物直接計數(shù)技術(shù)，是真正意義上的微生物直接計數(shù)，能夠?qū)鹘y(tǒng)的微生物計數(shù)檢測時間由數(shù)天縮短到數(shù)十分鐘，是微生物計數(shù)檢測技術(shù)的革命性發(fā)展。

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