杜冬生+程志紅+陳道峰

[摘要] 研究中藥紫花地丁Viola yedoensis的抗補(bǔ)體活性成分。采用硅膠、Sephadex LH-20等柱色譜方法，從紫花地丁全草95%乙醇提取物中分離得到15個(gè)化合物，通過(guò)波譜數(shù)據(jù)鑒定為生物堿類化合物，分別為：neoechinulin A（1）、N-benzoyl-L-p-hydroxy-phenylalaninol（2）、金色酰胺醇酯（3）、金色酰胺醇（4）、傘形香青酰胺（5）、栝樓酯堿（6）、吲哚-3-甲酸甲酯（7）、3-吲哚甲酸（8）、N-反式對(duì)羥基苯乙基阿魏酰胺（9）、N-p-香豆酰酪胺（10）、7′-（3′，4′-dihydroxyphenyl）-N-[（4-methoxyphenyl）ethyl]propenamide（11）、cannabisin F（12）、N-（4-hydroxyphenethyl）octacosanamide（13）、N-（4-hydroxyphenethyl）hexacosanamide（14）和N-benzoyl-L-phenylalaninol（15）。除化合物3和4外，其余化合物均為首次從該植物中分離得到?；衔?～6， 8～12對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典和旁路途徑有不同程度的抑制活性：對(duì)經(jīng)典途徑的CH50在0.12～0.33 g·L-1，對(duì)旁路途徑的AP50在0.22～0.50 g·L-1。對(duì)補(bǔ)體作用靶點(diǎn)研究表明，不同生物堿化合物其作用于補(bǔ)體的靶點(diǎn)不同。

[關(guān)鍵詞] 紫花地丁； 抗補(bǔ)體； 生物堿； 酰胺

[Abstract] Fifteen alkaloids were isolated from the 95% ethanol extract of the whole plants of Viola yedoensis by various column chromatographic techniques such as silica gel and Sephadex LH-20. Their structures were identified as neoechinulin A（1），N-benzoyl-L-p-hydroxy-phenylalaninol（2），aurantiamide acetate（3），aurantiamide（4），anabellamide（5），trichosanatine（6），indole-3-carboxylic acid methyl ester（7），3-carboxyindole（8），N-trans-feruloyl-tyramine（9），paprazine（10），7′-（3′， 4′-dihydroxyphenyl）-N-[（4-methoxyphenyl）ethyl]propenamide（11），cannabisin F（12），N-（4-hydroxyphenethyl）octacosanamide（13），N-（4-hydroxyphenethyl）hexacosanamide（14）and N-benzoyl-L-phenylalaninol（15）. All the compounds except 3 and 4 were isolated from this plant for the first time. These alkaloids exhibited anti-complement activity against the classical pathway（CP）and the alternative pathway（AP）with the CH50 and AP50 values ranging from 0.12 to 0.33 g·L-1 and 0.22 to 0.50 g·L-1， respectively. Preliminary mechanism study using complement-depleted sera showed that these alkaloids acted on different complement components in the complement activation cascade.

[Key words] Viola yedoensis； anti-complement； alkaloids； amides

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥帶根全草，味苦、辛，性寒，具有清熱解毒、涼血消腫等功效；用于治療黃疸內(nèi)熱、疔瘡腫毒、喉痹腫痛等疾病[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗凝血、調(diào)節(jié)免疫等作用[2-3]。紫花地丁的化學(xué)成分主要有黃酮及其苷類和香豆素類等[2-3]。為了進(jìn)一步了解紫花地丁的化學(xué)成分，本課題組對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，前期報(bào)道了從紫花地丁中分離鑒定的10個(gè)倍半萜類化合物[4]和6個(gè)黃酮碳苷類化合物[5]。本研究從紫花地丁全草的95%乙醇提取物中分離得到15個(gè)生物堿類化合物，分別鑒定為neoechinulin A（1）、N-benzoyl-L-p-hydroxy-phenylalaninol（2）、金色酰胺醇酯（3）、金色酰胺醇（4）、傘形香青酰胺（5）、栝樓酯堿（6）、吲哚-3-甲酸甲酯（7）、3-吲哚甲酸（8）、N-反式對(duì)羥基苯乙基阿魏酰胺（9）、N-p-香豆酰酪胺（10）、7′-（3′，4′-dihydroxyphenyl）-N-[（4-methoxyphenyl）ethyl]propenamide（11）、cannabisin F（12）、N-（4-hydroxyphenethyl）octacosanamide（13）、N-（4-hydroxyphenethyl）hexacosanamide（14）和N-benzoyl-L-phenylalaninol（15）。這些化合物除3和4外，均為首次從該植物中分離得到。對(duì)這些生物堿類化合物抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑和旁路途徑的抑制活性進(jìn)行了研究；在此基礎(chǔ)上對(duì)部分活性較強(qiáng)化合物作用于補(bǔ)體系統(tǒng)的靶點(diǎn)進(jìn)行了初步研究。endprint

1 材料

JASCO P-1020型全自動(dòng)旋光儀；Agilent SLG1946D型質(zhì)譜儀；Bruker DRX 400型核磁共振光譜儀；上海通微EasySep-1010型半制備液相色譜儀；柱色譜硅膠H（200～300 目）為青島海洋化工廠生產(chǎn)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠為瑞典Pharmacia公司生產(chǎn)；反相柱色譜硅膠填料為日本YMC公司生產(chǎn)；薄層色譜板為煙臺(tái)市芝罘黃務(wù)硅膠開(kāi)發(fā)試驗(yàn)廠生產(chǎn)；石油醚、丙酮、乙酸乙酯、乙醇等試劑為分析純。

紫花地丁購(gòu)自上海華宇藥業(yè)有限公司，經(jīng)復(fù)旦大學(xué)生藥學(xué)教研室程志紅副研究員鑒定為堇菜科植物紫花地丁V. yedoensis的干燥帶根全草，憑證標(biāo)本紫花地丁（No. DH2008082905）保存于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室。

2 提取和分離

干燥紫花地丁全草20 kg，室溫下以95%乙醇滲漉提取4次，減壓濃縮得浸膏812 g；浸膏懸浮于蒸餾水中，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物323 g、乙酸乙酯萃取物180 g。

乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮（0∶100～1∶1）梯度洗脫，得到7個(gè)部分（Fr. 1～Fr. 7）。Fr. 4（石油醚-丙酮20∶1洗脫部分，12.4 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（50∶1～5∶1）梯度洗脫，其中石油醚-乙酸乙酯（20∶1）部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜及Sephadex LH-20凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，1∶1）分離純化得到化合物1（15 mg），2（20 mg），3（14 mg），4（20 mg），5（67 mg），6（8 mg），7（16 mg）；石油醚-乙酸乙酯（10∶1）部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化得到化合物8（9 mg），9（18 mg），10（5 mg），11（8 mg），12（8 mg），13（19 mg），14（8 mg）。Fr. 5（石油醚-丙酮10∶1洗脫部分，21.5 g）經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯（20∶1～5∶1）梯度洗脫，其中石油醚-乙酸乙酯（20∶1）部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜及Sephadex LH-20凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，1∶1）分離純化得到化合物15（39 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

4 體外抗補(bǔ)體活性與補(bǔ)體作用靶點(diǎn)研究

4.1 經(jīng)典途徑和旁路途徑抗補(bǔ)體活性測(cè)定[19] 抗補(bǔ)體活性測(cè)定按照本課題組前期報(bào)道的方法進(jìn)行。測(cè)定了所有化合物1～15的抗補(bǔ)體活性，結(jié)果見(jiàn)表1。化合物1～6和8～12對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典和旁路途徑有不同程度的抑制活性，CH50和AP50分別為0.12～0.33 g·L-1和0.22～0.50 g·L-1。這些酰胺類生物堿可分為含有苯酰胺片段（2～6，15）和苯丙酰胺片段（9～14）2種，存在苯酰胺片段的化合物中傘形香青酰胺（5）活性最強(qiáng)，CH50和AP50分別為（0.12±0.07） g·L-1和（0.22±0.06 ） g·L-1，其次是3，4，6。具有苯丙酰胺片段的化合物中cannabisin F（12）活性最強(qiáng)，CH50和AP50分別為（0.16±0.07），（0.26±0.11） g·L-1，其次是10，9，11。本文中的酰胺生物堿類化合物抗補(bǔ)體活性為首次報(bào)道。

4.2 部分活性化合物的補(bǔ)體作用靶點(diǎn)確定[19] 為進(jìn)一步了解這些抗補(bǔ)體活性酰胺生物堿的補(bǔ)體抑制作用，本研究也按照本課題組前期報(bào)道的方法分別選取含苯酰胺片段的化合物4和5以及含苯丙酰胺片段的化合物9和10進(jìn)行抗補(bǔ)體作用靶點(diǎn)的研究，結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)的C1q，C2，C5，C9組分，化合物4的靶點(diǎn)組較相應(yīng)缺失血清組溶血能力未能恢復(fù)；而對(duì)于C3和C4組分，化合物4的靶點(diǎn)組較相應(yīng)的缺失血清組溶血能力顯著恢復(fù)，表明化合物4作用于補(bǔ)體系統(tǒng)的C1q，C2，C5，C9組分，見(jiàn)圖1A。類似的，化合物5，9，10分別作用于補(bǔ)體的C1q，C2，C3，C5，C9，見(jiàn)圖1B；C1q，C3，C9，見(jiàn)圖1C；和C1q，C3，C5，C9組分，見(jiàn)圖1D。這4個(gè)化合物均作用于補(bǔ)體系統(tǒng)的C1q和C9組分，不同之處在于是否還同時(shí)作用于補(bǔ)體的C2，C3或C5組分。該研究表明，盡管這些化合物均具有抗補(bǔ)體活性，但是其在補(bǔ)體作用靶點(diǎn)上并不完全相同。

5 討論

本研究從紫花地丁全草95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分離鑒定了15個(gè)酰胺生物堿類化合物，其中13個(gè)化合物為首次從紫花地丁中分離得到。同時(shí)對(duì)分離得到的所有化合物進(jìn)行了體外抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑和旁路途徑的抗補(bǔ)體活性篩選，進(jìn)而對(duì)部分活性化合物的補(bǔ)體作用靶點(diǎn)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，11個(gè)化合物能夠不成程度地通過(guò)經(jīng)典途徑或旁路途徑發(fā)揮抗補(bǔ)體作用。且補(bǔ)體作用靶點(diǎn)研究表明，這些活性化合物的補(bǔ)體作用靶點(diǎn)并不完全相同，提示紫花地丁中不同的化合物可通過(guò)抑制補(bǔ)體不同靶點(diǎn)或多靶點(diǎn)發(fā)揮抗補(bǔ)體作用。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint