姜臘+徐煥華+江珍紅+楊詩涵+史巧莉+馬增春+高月+陳志武

[摘要] 對收集到的市售3個生產(chǎn)廠家的水飛雄黃采用HPLC-ICP-MS分析其砷的形態(tài)及不同形態(tài)砷的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3家企業(yè)游離As（Ⅲ）均未超過藥典限值，但按游離砷[As（Ⅲ）+As（Ⅴ）]的總值計算，1家企業(yè)超出藥典限值?，F(xiàn)有藥典游離砷檢定方法為古蔡氏檢砷法，存在一定局限性，未能有效規(guī)避三價砷以外的其余價態(tài)砷伴生的毒性風(fēng)險。隨后考察了水分和溫度對水飛雄黃中可溶性砷的含量及形態(tài)的影響。結(jié)果表明：①水分對水飛雄黃中可溶性砷的含量有顯著影響，隨著水分的含量的增加，可溶性砷的含量呈上升趨勢，形態(tài)未發(fā)生改變，僅有As（Ⅲ）和As（Ⅴ）；②單純性的溫度因素，樣品中可溶性砷的含量變化存在增多趨勢，最大增量分別是As（Ⅲ） 2.489 mg·g-1，As（Ⅴ） 0.546 mg·g-1；③當(dāng)水分與溫度共同作用時，樣品中可溶性砷的增加量發(fā)生顯著變化，最大增量分別是As（Ⅲ） 23.690 mg·g-1，As（Ⅴ） 0.468 mg·g-1。綜合分析認為：雄黃質(zhì)量容易受到水分和溫度的影響，單純的水分，以及水分和溫度共同作用均能顯著改變雄黃中可溶性砷的含量，水分為高危因素。現(xiàn)行《中國藥典》2015年版中游離砷的檢測方法存在局限性，新的技術(shù)應(yīng)當(dāng)被引進；于此同時，現(xiàn)行藥典中雄黃藥材項下未設(shè)置水分檢查項，應(yīng)當(dāng)補足。

[關(guān)鍵詞] 雄黃； 水分； 溫度； 可溶性砷； 質(zhì)量研究

[Abstract] The results of a toxicity analysis showed differences from those of the existing experimental data. Therefore， HPLC-ICP-MS was used to analyze the soluble arsenic content at different valences in realgar prepared with water grind processing， which were collected from 3 companies. The results showed that the free arsenic of the 3 companies did not exceed the limit of Chinese Pharmacopoeia. However， if the free arsenic was calculated based on the total value of As（Ⅲ） + As（Ⅴ）， free arsenic of 1 company exceeded the limit of Chinese Pharmacopoeia. The method of determining free arsenic in Chinese Pharmacopoeia. was ancient Cai′s arsenic detection method， which had a certain limitation and failed to effectively avoid the toxicity of remaining arsenics except for trivalent arsenic. Then， we examined the effects of water and temperature on the content and form of soluble arsenic in realgar. The results showed that the content of soluble arsenic increased with the rise of water content， and the form of soluble arsenic did not change， there were only As （Ⅲ） and As （Ⅴ）； With the simple temperature factor， there was an increasing trend in the content of soluble arsenic in the samples， the maximum increment was As （Ⅲ） 2.489 mg·g-1 and As （Ⅴ） 0.546 mg·g-1； When water and temperature played an synergistic effect， the increase of soluble arsenic in the samples significantly changed， the maximum increment was As （Ⅲ） 23.690 mg·g-1， As （Ⅴ） 0.468 mg·g-1， respectively. Through comprehensive analysis， we believed that the quality of realgar was susceptible to water content and temperature. Both of the single effect of water content and the synergistic effect of water and temperature can significantly change the content of soluble arsenic in realgar， and the water content was a high-risk factor. In the current Chinese Pharmacopoeia 2015 version， the free arsenic detection method had limitations， hence new techniques shall be introduced； At the same time， realgar does not have a water content inspection item in the current pharmacopoeia， which shall be added. However， due to the limit of water content， more in-depth studies are required.endprint

[Key words] realgar； water content； temperature； soluble arsenic； quality control

筆者對復(fù)方黃黛片方中各組分配伍毒性研究結(jié)果進行分析時發(fā)現(xiàn)，雄黃單用組LD50與已有研究[1]報道的LD50（20 500 mg·kg-1）相差顯著。進一步分析顯示，本研究使用的雄黃中可溶性砷達27.777 mg·g-1[其中As（Ⅲ）=21.968 mg·g-1，As（Ⅴ）=5.809 mg·g-1]，為參考文獻的16.38倍[1]，亦超過藥典對雄黃中三氧化二砷的限定值（7.020 mg·g-1） [2]。然而本研究中使用的雄黃與上述文獻中使用的為同一批號，其毒性結(jié)果卻差異巨大，提示雄黃在其生產(chǎn)之后的節(jié)點中存在易于改變其質(zhì)量的影響因素。

目前所發(fā)表的文獻中，雄黃的質(zhì)量研究大多數(shù)聚焦于晶型[3]、主成分含量[4]、炮制方法[5]、重金屬雜質(zhì)[6]等，較少關(guān)注可溶性砷的形態(tài)及含量。質(zhì)量控制主要關(guān)注生產(chǎn)過程，容易忽視生產(chǎn)之后的節(jié)點，如運輸、儲藏、臨床應(yīng)用等。質(zhì)量檢測方法也較為落后，如《中國藥典》2015年版使用的古蔡氏檢砷法、多數(shù)研究中使用的原子熒光法[7]，這2種方法存在不能準確定量以及不能區(qū)分砷形態(tài)等缺點。而先進的砷形態(tài)分析法[8]HPLC-ICP-MS卻尚未普及[9-10]。

基于上述現(xiàn)狀及事實，作者擬對收集到的市售3家企業(yè)的水飛雄黃的質(zhì)量進行研究，并初步探究其影響因素。期望能提示使用水飛雄黃的科研人員注意關(guān)注其本身質(zhì)量，并指導(dǎo)臨床的合理用藥，規(guī)避因藥物質(zhì)量因素引起的不良反應(yīng)的發(fā)生。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（Agilent），7700x型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（Agilent. USA），Dionex Ionpac AS19 陰離子交換柱（4 mm ×250 mm，10 μm，Thermo Fisher. USA），DHG 9240型干燥箱（北京陸?？萍迹?，高速離心機（Beckman Coulter，Inc. USA），Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)（Millipore USA）。

1.2 藥材及試劑

水飛雄黃（收集到3家企業(yè)，在此文章中分別以A，B，C企業(yè)代替）；色譜級乙腈、甲醇（Thermo Fisher. USA）；亞砷酸根離子As（Ⅲ） （GBW08666）、砷酸根離子As（Ⅴ） （GBW08667）、一甲基砷MMA（Ⅴ） （GBW08668）、二甲基砷DMA（Ⅴ） （GBW08669）、砷甜菜堿AsB （GBW08670）等砷標準物質(zhì)均購自中國計量科學(xué)院；水為超純水，電阻率18.2 MΩ·cm，背景檢測無干擾；其余試劑均為優(yōu)級純。

2 方法

2.1 干燥失重法測定樣品含水量

精密稱取水飛雄黃1.000 g，置于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，按《中國藥典》2015版一部附錄Ⅸ G干燥失重測定法測定。

2.2 市售樣品中可溶性砷形態(tài)分析及其含量測定

2.2.1 樣品前處理 精密稱取水飛雄黃1.000 g，加入超純水50 mL，振搖提取4～6次，合并提取液，500 mL量瓶定容、稀釋至所需濃度，0.22 μm濾膜過濾上機測定。

2.2.2 HPLC-ICP-MS測定不同形態(tài)砷的含量 本研究中砷形態(tài)分析及含量測定的工作由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所血液藥理研究室藥物代謝重點實驗室?guī)椭瓿?，測定方法參考文獻[9]。

2.3 水分對水飛雄黃中可溶性砷的影響

實驗執(zhí)行前，去除水飛雄黃樣品中的可溶性砷，作為對照?？扇苄陨槿コ椒ǎ悍Q取水飛雄黃適量，加入超純水50 mL，振搖、離心、去上清，重復(fù)4～6次，最后一次，抽濾，得濾渣烘干即得。實驗方案見表1。

實驗執(zhí)行前，對2組樣本中的水分和可溶性砷含量進行質(zhì)控。密封，放置于常溫，分別于7，14，28 d取樣測定。

2.4 溫度對水飛雄黃中可溶性砷的影響

樣品前處理同2.3項下，溫度對水飛雄黃中可溶性砷的影響實驗方案見表2。樣品密封，放置于4 ℃、常溫、60 ℃環(huán)境，分別于7，14，28 d取樣測定。

2.5 溫度與水分共同作用對水飛雄黃中可溶性砷的影響

樣品前處理同2.3項下，實驗方案見表3。樣品密封，按實驗方案放置，分別于7，14，28 d取樣測定。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)用±s表示，采用SAS 8.1軟件2因素析因設(shè)計的方差分析進行組間比較，采用Graphpad prism軟件作圖。

3 結(jié)果

3.1 市售的3批樣品中水分及可溶性砷的含量

3批次樣品，游離砷含量檢查均符合《中國藥典》2015年版中古蔡氏檢砷法的規(guī)定，見表4。As（Ⅲ）的質(zhì)量分數(shù)均低于7.02 mg·g-1，但若以As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的總和計算，批次為2的樣品中游離砷的含量超出藥典限度。與此同時，按照2015年版《中國藥典》對雄黃中主成分硫化砷的檢查結(jié)果表明，硫化砷質(zhì)量分數(shù)均在藥典規(guī)定的不小于90%的范圍內(nèi)。

3.2 各影響因素下，雄黃中可溶性砷的含量變化

3.2.1 水分對雄黃中可溶性砷的影響 樣品中可溶性As（Ⅲ）的增加量與樣品中水分的含量呈正相關(guān)趨勢，見圖1，可溶性As（Ⅴ）數(shù)據(jù)雖出現(xiàn)波動，但總體趨勢依然為正相關(guān)。且在時間維度上，隨著取樣時間的延長，可溶性As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的增加趨勢更為顯著。為排除樣品本身攜帶的可溶性砷的影響，以實驗開始前已去除可溶性砷的樣品作為對照，趨勢重現(xiàn)性良好。

3.2.2 溫度對雄黃中可溶性砷的影響 單純的溫度因素影響下，樣品中可溶性As（Ⅲ）的含量變化存在增多趨勢，見圖2，最大增量為60 ℃、28 d、未去除可溶性砷的樣本，其As（Ⅲ）增加的量為2.489 mg·g-1。As（Ⅴ）含量變化趨勢一致，最大增量為0.546 mg·g-1。endprint

3.2.3 溫度和水分共同作用對雄黃中可溶性砷的影響 在溫度和水分的共同作用下，樣品中可溶性As（Ⅲ）的含量隨著取樣時間的延長而劇增，見圖3，最大增量為為60 ℃、 28 d、去除可溶性砷的樣本，其As（Ⅲ）的增量為23.690 mg·g-1。與單純的溫度或水分作用相比，數(shù)值變化具有顯著性差異。As（V）含量變化也顯升高趨勢，最大增量為0.468 mg·g-1，與單純的溫度或水分作用相比，數(shù)值變化沒有顯著性差異。

4 討論與建議

中藥安全性的評價存在諸多難點，如中藥成分復(fù)雜、毒性機制復(fù)雜、中藥作用多途徑、配伍應(yīng)用多樣性、中藥效應(yīng)多靶點、毒理效應(yīng)綜合性[11-12]，如何克服這些難點，探清中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)、毒性機制是中藥安全性評價目前面臨的一大困境。而藥材基原清楚、質(zhì)量可控是安全性評價的大前提，考慮到雄黃為確有療效的有毒中藥，特別是隨著砷劑在白血病及腫瘤方面的優(yōu)越療效。其安全性已受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。而全面的安全性評價是雄黃走向國際市場的基礎(chǔ)，為更好的評價其安全性，雄黃的質(zhì)量控制研究勢在必行。

最新文獻表明，雄黃中的可溶性砷，特別是As（Ⅲ），既是雄黃發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是產(chǎn)生毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)[13]，可溶性砷在雄黃中扮演著毒效一體的角色?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)鼻祖、希臘醫(yī)生巴拉塞爾薩斯有一句名言：“萬物皆有毒，關(guān)鍵在劑量”。因此控制雄黃中可溶性砷的含量是安全應(yīng)用雄黃的前提。

在本研究中，考察了水分和溫度2個因素對雄黃中可溶性砷含量的影響，結(jié)果表明水分和溫度均能引起可溶性砷含量的變化，且水分是高危因素。雄黃中隨著水分的增加，可溶性砷的含量顯著上升，且高溫能催化這一現(xiàn)象。但現(xiàn)行《中國藥典》2015年版中，雄黃藥材項下缺失水分檢查項目，可能帶來安全隱患?；谀壳埃瑑H考察了收集到的3批雄黃樣本，尚不能合理的制定水分的限值，這也是本研究的局限性，此部分還需要更廣泛、更深入的后續(xù)研究。研究結(jié)果雖然能推論出水分越低，雄黃的質(zhì)量越穩(wěn)定，但質(zhì)量的穩(wěn)定并不一定能帶來最大的療效收益，因為效和毒的物質(zhì)基礎(chǔ)均為可溶性砷As（Ⅲ）。在此前提下，認為直接標示藥材中含有的可溶性砷的形態(tài)以及各形態(tài)砷的準確含量不失為一個更好的解決方案。

因此建議：①更新藥典標準，引入HPLC-ICP-MS分析技術(shù)監(jiān)控雄黃中可溶性砷的含量，并關(guān)聯(lián)分析砷的形態(tài)；②雄黃的藥典標準中，補充“水分檢查”項目，控制水分；③臨床使用前，若能動態(tài)監(jiān)控，及時根據(jù)雄黃中可溶性砷的含量調(diào)整雄黃的給藥劑量，并警示雄黃可能的毒性危害，監(jiān)測患者血液中可溶性砷的形態(tài)及濃度。筆者期望不僅能避免雄黃可能的毒性危害，更期望能促進雄黃在全球范圍內(nèi)的廣泛接受和使用。雄黃，以毒為能、毒效并存，可控的質(zhì)量是其被接受的前提，也是其生命線。

[參考文獻]

[1] 梁愛華，李春英，王金華，等.雄黃的毒性研究[J].中國中藥雜志，2011，36（12）：1889.

[2] 中國藥典.一部[S].2015：336

[3] 張永文，馬秀璟，陽長明.含朱砂、雄黃的中藥制劑的質(zhì)量控制及安全性評價問題分析[J]. 中國中藥雜志，2010，35（11）：1501.

[4] 李莎莎，林青華，徐何方，等.市售雄黃藥材及飲片質(zhì)量考察[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2016，44（2）：10.

[5] 裴月梅，楊士友，顧家華.牛黃解毒顆粒劑制備工藝中雄黃的炮制方法及其可溶性砷鹽的含量測定[J].中國中藥雜志，1995，20（10）：599.

[6] 李朝峰. 雄黃及含雄黃中成藥的質(zhì)量控制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[7] 李化，趙明惠，梁愛華，等. 不同產(chǎn)地雄黃及其炮制品中二硫化二砷和可溶性砷含量比較[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（2）：49.

[8] 張云靜，強淑萍，宋敏，等. 大鼠口服雄黃和牛黃解毒片后血漿中砷形態(tài)的研究[J].分藥學(xué)學(xué)報，2016，51（7）：1130.

[9] 陳紹占，杜振霞，劉麗萍，等.高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜法分析雄黃在大鼠臟器中代謝的砷形態(tài)[J].分析化學(xué)研究報告，2014，42（3）：349.

[10] 陳紹占，劉麗萍，杜振霞，等.食品中砷化合物的形態(tài)及分析技術(shù)[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2014，26（3）：296.

[11] 葉祖光，張廣平.中藥安全性評價的發(fā)展、現(xiàn)狀及其對策[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（16）：1.

[12] 賈偉，蔣健，劉平，等. 代謝組學(xué)在中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系研究中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志，2006，31（8）：621.

[13] Griffin. Blood′s 70th anniversary： arsenic—from poison pill to magic bullet [J].Blood， 2016，127 （14）， 1729.

[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint