郝麗珊+郜玉鋼+臧埔+趙巖+何忠梅+祝洪艷+楊鶴+劉雙利+柳靖婷+張連學(xué)

[摘要] 通過(guò)PCR引物檢測(cè)人參DNA特異性片段，快速、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)低齡人參種質(zhì)質(zhì)量，加快人參育種進(jìn)程。該研究基于個(gè)體之間的基因差異，設(shè)計(jì)7對(duì)引物，通過(guò)比對(duì)不同人參DNA的擴(kuò)增圖譜與皂苷含量相關(guān)性，成功得到一對(duì)特異性引物GC1，并采用L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化其25 μL PCR體系，各組分最佳配比為：DNA 2.60 mg·L-1，Mg2+ 1.44 mmol·L-1，dNTP 0.19 mmol·L-1，引物0.32 μmol·L-1，Taq 0.076 U·μL-1。對(duì)GC1引物進(jìn)行驗(yàn)證，在24株供試人參中有2株擴(kuò)增出1 200 bp特異性條帶陽(yáng)性樣品，2株陽(yáng)性樣品中9種單體皂苷及其加和值含量均較高。該特異性條帶序列與甘油-3-磷酸脫氫酶同源性達(dá)99%。GC1可以作為一種高皂苷人參株系早期篩選鑒定方法的特異性引物，有利于加快人參育種進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞] 人參育種； PCR； 引物篩選； 體系優(yōu)化

[Abstract] The study aims at screening the specific bands by PCR， quickly and accurately evaluating the quality of ginseng seeding， accelerating the process of ginseng breeding. Based on the correlation of genetic differences and saponin content between individuals， a pair of specific primer GC1 was screened by PCR. According to the experiment by L16 （45） orthogonal test， a PCR system most suitable for GC1 was established， which came out total 25 μL reaction system containing DNA 2.60 mg·L-1， Mg2+ 1.44 mmol·L-1， dNTP 0.19 mmol·L-1， primer 0.32 μmol·L-1and Taq enzyme concentration 0.076 U·μL-1. By comparing the saponin content and the GC1 PCR electrophoretogram of samples， the ginseng， with 1 200 bp specific band by PCR of GC1， the contents of 9 monosodium saponins and their additions were higher than others， which provided a reliable method for accelerating the process of ginseng breeding. The sequence was sequenced and 99% homologous to glycerol-3-phosphate dehydrogenase.

[Key words] ginseng breeding； PCR； primer screening； system optimization

人參皂苷具有多種生理、藥理功能，其含量是衡量人參品質(zhì)、培育新品種的重要指標(biāo)之一。但其含量很低，稀有皂苷含量更低，而且尚未實(shí)現(xiàn)全化學(xué)合成，嚴(yán)重限制了人參的開發(fā)和應(yīng)用。長(zhǎng)久以來(lái)，培育高皂苷含量的新人參品種，是解決該問(wèn)題的有效途徑，然而由于人參世代間隔長(zhǎng)的原因，傳統(tǒng)的人參育種方法存在周期長(zhǎng)，人力、物力消耗大等不足。本研究在前期的研究基礎(chǔ)之上，篩選高皂苷株系的特異性引物，優(yōu)化PCR體系，通過(guò)檢測(cè)人參特異性DNA片段的有無(wú)，從而快速、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)低齡人參種質(zhì)質(zhì)量，為建立人參優(yōu)良品種早期篩選先進(jìn)方法提供依據(jù)，從而加快育種進(jìn)程。

1 材料

2016年9月中旬，于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥植園隨機(jī)采取48株四年生種植人參，樣品所處環(huán)境和管理?xiàng)l件均相同，24株用于特異基因篩選方法建立，24株用于特異基因篩選方法驗(yàn)證。

植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自Tiangen公司；PCR試劑均購(gòu)自Takara公司；乙腈、甲醇均為色譜純；水為去離子水；其余試劑為分析純。

Infinite M200PRO連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、安捷倫Sure Cycler 8800梯度PCR儀、電泳儀DYY-6B（北京六一儀器廠）、英國(guó)SYNGEN GGM/D2凝膠成像系統(tǒng)、日本島津AUY220電子分析天平、日本島津LC-2010A高效液相色譜儀（LC-2010A型液相色譜泵、LC-2010A 型自動(dòng)進(jìn)樣器、CLASS-vP色譜工作站）。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)，使用Primer 5設(shè)計(jì)7對(duì)引物[1]，引物序列見表1，由大連寶生物合成。

2.2 DNA的提取及檢測(cè) 用蒸餾水洗去供試人參表面泥土，然后用70%乙醇進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水沖凈，最后用凍干機(jī)干燥，分別無(wú)菌條件下單株粉碎，隨機(jī)編號(hào)。按照試劑盒說(shuō)明提取24株供試人參基因組DNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)所得DNA質(zhì)量和濃度，稀釋至50 mg·L-1，1%瓊脂糖凝膠電泳，-20 ℃保存。

2.3 特異性引物篩選 按說(shuō)明書依次加入PCR Mix，ddH2O，人參DNA和上下游引物混勻得25 μL體系，反應(yīng)程序[2]：94 ℃預(yù)變性4 min；前5個(gè)循環(huán)在94 ℃變性1 min，45 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸10 s；接下來(lái)的30個(gè)循再94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸10 s；循環(huán)結(jié)束72 ℃延伸5 min。0.1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。精確稱取各株人參粉末1.00 g，參照文獻(xiàn)測(cè)定供試人參16種皂苷[3]，結(jié)果運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析（P<0.05）。對(duì)比結(jié)果，篩選特異性引物。endprint

2.4 特異性引物PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 以回收2.3特異性條帶為優(yōu)化模板DNA，對(duì)模板DNA、引物、dNTP、Mg2+和Taq酶5個(gè)因素的適宜濃度進(jìn)行優(yōu)化[4-6]，具體見表2，PCR反應(yīng)程序同上。

采用L16（45）正交試驗(yàn)確定該P(yáng)CR反應(yīng)體系5個(gè)因素的最優(yōu)組合，每個(gè)因素依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定4個(gè)水平。正交試驗(yàn)水平信息見表3。

2.5 特異性引物PCR反應(yīng)驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)化的PCR體系對(duì)另24株供試人參基因進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果。測(cè)定和分析各株人參皂苷，方法同2.3，驗(yàn)證引物的準(zhǔn)確性。

2.6 特異性片段測(cè)序與分析 使用凝膠回收試劑盒回收特異性條帶，并送往TKARA公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取 供試人參DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰，見圖1。經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)，DNA樣品A260/A280均在1.8～2.0，說(shuō)明所提DNA完整性好，純度較高，可作為PCR的模板。

3.2 特異性引物篩選 引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2，僅GC1引物的13，14號(hào)樣品分別在約2 000，1 200 bp處各有1條特異性條帶，14號(hào)人參樣品9種皂苷加和值最高，見圖3和表4。

3.3 特異性引物PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 GC1引物的最優(yōu)PCR體系為：DNA質(zhì)量濃度2.60 mg·L-1，Mg2+1.44 mmol·L-1，dNTP 0.19 mmol·L-1，引物0.32 μmol·L-1、Taq酶0.076 U·μL-1，見圖4。

3.4 特異性引物PCR反應(yīng)體系驗(yàn)證 27和45樣品檢測(cè)出1 200 bp特異性條帶，其對(duì)應(yīng)的人參樣品9種皂苷加和值最高見圖5和表5。

3.5 特異性片段測(cè)序及比對(duì) 該特異性條帶測(cè)序?yàn)? 104 bp，經(jīng)BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，與甘油-3-磷酸脫氫酶同源性較高，相似度達(dá)99%；對(duì)該序列進(jìn) 行完整閱讀框查找，見圖6，從569～1 102 bp翻譯177 aa蛋白質(zhì)，經(jīng)查閱為甘油-3-磷酸脫氫酶。

4 討論

PCR技術(shù)致力于DNA，不受組織、生長(zhǎng)時(shí)期及環(huán)境的影響，在人參真?zhèn)舞b定[7-10]、品種鑒定[11-12]、地域鑒定[13]、聚類分析[14-15]及DNA條形碼[16-17]等 方面的應(yīng)用也非常廣泛?；趥€(gè)體之間的基因差異，本研究利用PCR技術(shù)比較擴(kuò)增圖譜與皂苷含量之間的相關(guān)性，成功篩選出引物GC1，該引物及其PCR優(yōu)化體系可用來(lái)檢測(cè)人參幼苗，從而有利于快速、準(zhǔn)確的篩選人參皂苷高產(chǎn)株系，為人參育種提供理論依據(jù)和參考。

在人參萜類化合物合成的過(guò)程中，同時(shí)存在甲羥戊酸途徑（MVA）和丙酮酸途徑（MEP）[18]，其中MEP以糖酵解中間產(chǎn)物丙酮酸和甘油醛-3-磷酸為前體經(jīng)酶作用合成IPP和DMAPP[19]，而相關(guān)研究表明甘油-3-磷酸脫氫酶是催化糖酵解中間產(chǎn)物——磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化生成甘油-3-磷酸（Gly3p）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的關(guān)鍵酶[20-22]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)的特異性條帶為人參的甘油-3-磷酸脫氫酶基因，其促使了磷酸二羥丙酮向甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化，為人參皂苷合成的MEP提供前體物質(zhì)，從而促進(jìn)人參皂苷合成、積累。

甘油-3-磷酸脫氫酶為植物代謝途徑的基本基因，完全缺失的可能性很小。本實(shí)驗(yàn)?zāi)０鍨槿藚NA，作者考慮為個(gè)體或人參品種間的基因差異，可能為基因轉(zhuǎn)座導(dǎo)致目標(biāo)基因拷貝數(shù)增多，引起基因豐度差異；有可能為基因大片段重組，形成較強(qiáng)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，使目標(biāo)基因過(guò)量表達(dá)，引起人參皂苷差異。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]endprint