王奎龍+李卓瓊+曹澤彧+柯志鵬+曹亮+王振中+蕭偉

[摘要] 為研究銀杏二萜內(nèi)酯A，B，K（GA，GB，GK）對家兔血小板聚集功能的影響，比較三者作用機(jī)制的異同及強(qiáng)弱，該研究采用體外實驗法，觀察不同劑量GA，GB，GK對血小板活化因子（PAF）誘導(dǎo)家兔血小板聚集作用的影響。研究結(jié)果顯示，3種銀杏二萜內(nèi)酯均可抑制PAF誘導(dǎo)的體外家兔血小板聚集，其強(qiáng)弱順序為GK>GB>GA；三者還能夠拮抗[3H]PAF與PAF受體的特異性結(jié)合，拮抗能力同樣為GK>GB>GA。進(jìn)一步研究三者對于PAF誘導(dǎo)后血小板中胞內(nèi)[Ca2+]i動員及胞內(nèi) cAMP水平的變化，發(fā)現(xiàn)三者均能夠劑量依賴性的抑制胞內(nèi)[Ca2+]i動員并提高胞內(nèi)cAMP水平，且它們的作用強(qiáng)弱與拮抗PAF受體能力的強(qiáng)弱一致。表明銀杏二萜內(nèi)酯GK對于PAF受體具有高度的選擇性，并能夠通過激活cAMP信號通路、抑制胞內(nèi)[Ca2+]i動員的方式達(dá)到抑制血小板聚集的目的，GB、GA對PAF受體也有較強(qiáng)的拮抗作用，但弱于GK。

[關(guān)鍵詞] 銀杏二萜內(nèi)酯A； 銀杏二萜內(nèi)酯B； 銀杏二萜內(nèi)酯K； 血小板聚集； 血小板活化因子（PAF）

[Abstract] To investigate the effects of ginkgolide A （GA）， ginkgolide B （GB） and ginkgolide K （GK） on platelet aggregation in rabbits， and compare the similarities and differences among these three components. The effects of different doses of ginkgolide A， B and K on platelet aggregation induced by platelet activating factor （PAF） were observed by using in vitro experiment. The results showed that three compounds could inhibit platelet aggregation induced by PAF in vitro， and the intensity was GK>GB>GA. It was further found that all of them can mobilize [Ca2+]i and enhance intracellular c-AMP level in a dose-dependent manner， which was consistent to the ability to antagonize PAF receptor. These findings indicated that GK was highly selective for PAF receptor， and may inhibit platelet aggregation by activating cAMP signaling pathway and inhibiting intracellular [Ca2+]i mobilization； GB and GA also had strong antagonism to PAF receptor， but the effect was weaker than that of GK.

[Key words] ginkgolide A； ginkgolide B； ginkgolide K； platelet aggregation； platelet activating factor （PAF）

缺血性腦卒中是危害全球的疾病，具有高致殘、高致死率，且復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重危害人類健康。目前臨床對于缺血性腦卒中的治療從機(jī)制上可以分為溶栓和抗血小板，前者如重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogenactivator，rt-PA），但該類制劑也存在治療時間窗窄（4.5 h內(nèi)）、不良反應(yīng)嚴(yán)重等問題，因而通過其獲益的患者不足3%。所以目前市場上對于腦卒中的治療，抗血小板藥仍占據(jù)重要地位，加強(qiáng)對該類藥物的研究具有廣闊的前景[1-3]。

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液屬于中藥五類新藥，具有活血通絡(luò)之功效，臨床用于腦梗死（中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)痰瘀阻絡(luò)證）的治療，癥見半身不遂、口舌歪斜、言語謇澀、肢體麻木等。其成分明確，主要由銀杏二萜內(nèi)酯A（ginkgolide A，GA）、銀杏二萜內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）、 銀杏二萜內(nèi)酯K（ginkgolide K，GK）組成。目前對于銀杏二萜內(nèi)酯B的研究已經(jīng)比較深入，GB是目前已知天然產(chǎn)物中活性最強(qiáng)的PAF受體拮抗劑之一[4-5]。作為與GB結(jié)構(gòu)母核相同的GA和GK，是否具有相同的作用特點，三者的作用強(qiáng)度又如何？為此，本文研究了三者對于PAF誘導(dǎo)家兔血小板聚集作用的影響及特異性拮抗PAF與PAF受體結(jié)合的強(qiáng)弱，并比較了三者對于PAF誘導(dǎo)后血小板內(nèi)[Ga]2+i動員和cAMP水平的影響，以期探討3種銀杏二萜內(nèi)酯拮抗血小板聚集作用機(jī)制的異同，闡明銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液治療腦梗死的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物 銀杏二萜內(nèi)酯A（ginkgolide A，GA），白色針晶，純度>98%，分子式C20H24O9，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供；銀杏二萜內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB），白色粉末，純度>98%，分子式C20H24O10，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供；銀杏二萜內(nèi)酯K（ginkgolide K，GK），白色粉末，純度>98%，分子式C22H20O12，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 試劑 血小板活化因子（PAF）（Sigma-Aldrich，批號BCBM4010V），枸櫞酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20120921），F(xiàn)luo-4 NW染料（Molecular Probes TM，批號F36206），cAMP ELISA 試劑盒購（R&D Systems，批號20121526），DMSO（Sigma，批號20128756），[3H]PAF（American Radiolabeled Chemicals Inc，ART1599），甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20160426），甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20121127）。endprint

1.3 實驗動物 健康新西蘭兔6只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雄性（由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，許可證號SCXK（蘇）2012-0008，質(zhì)量合格證號201311283）。

1.4 儀器 SC2000血小板聚集分析儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）；LD4-1.2臺式自動平衡離心機(jī)，（北京京立離心機(jī)有限公司）；METTLER-XL205電子天平（梅特勒-托利多上海儀器有限公司），EnSPire 2300多功能酶標(biāo)儀（Multilabel Plate Reader，PerkinElmer，USA），紅外線快速干燥器RQ-305型（上海云被電工電訊器材廠），液體閃爍計數(shù)儀（Wallac GUARDIAN 1414 Liquid scintillation counter）。

2 方法

2.1 溶液的配制 將血小板活化因子（PAF）溶解于0.9%生理鹽水中，使其終濃度分別為1 mg·L-1；枸櫞酸鈉溶于蒸餾水中，質(zhì)量濃度為4%。

2.2 家兔體外血小板聚集實驗 取雄性新西蘭兔6只，利多卡因局部麻醉，頸動脈插管取血，枸櫞酸鈉（4%） 1∶9 抗凝，以800 r·min-1離心10 min，取上清液，該上清液為富血小板血漿（PRP），剩余部分以3 000 r·min-1離心15 min，取上清液為貧血小板血漿（PPP），將PPP 加入到PRP 中，使PRP 含有的血小板數(shù)目在4×108 個/mL。聚集誘導(dǎo)劑用PAF（1 mg·L-1）。每管260 μL PRP 中加入不同濃度生理鹽水稀釋的藥物30 μL（DMSO終濃度不超過0.1%），對照組PRP中加入生理鹽水30 μL（含0.1%DMSO），同時設(shè)立生理鹽水組（30 μL，不含DMSO），溫育5 min，然后加入10 μL誘導(dǎo)劑，觀察5 min內(nèi)血小板聚集情況并記錄最大（MAX）血小板聚集率[3]。并按下述公式計算抑制率，血小板聚集抑制率=（對照組血小板聚集率-給藥組血小板聚集率）/對照組血小板聚集率×100%。以藥物濃度自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，建立相關(guān)方程，通過方程計算抑制率為50%時的藥物濃度，即半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration 50，IC50）。

2.3 銀杏二萜內(nèi)酯A，B，K對PAF與PAF受體結(jié)合的特異性拮抗作用 參考文獻(xiàn)研究方法[4]，調(diào)整血小板數(shù)為4×108 個/mL，每個反應(yīng)孔中加入[3H]PAF（終濃度為2.02×10-4 nmol·L-1），非特異性結(jié)合孔中加入未標(biāo)記的PAF（終濃度為3.69×103 nmol·L-1），競爭性結(jié)合孔中加入不同濃度的化合物GA，GB，GK（9.425×10-5，9.425×10-4，9.425×10-3，9.425×10-2，9.425×10-1，9.425，9.425×101，9.425×102 nmol·L-1，每個濃度設(shè)立3個復(fù)孔），總結(jié)合孔和非特異性結(jié)合孔中加入空白溶劑，室溫下反應(yīng)10 min后，玻璃纖維濾膜抽濾，用2 mL含0.1%BSA的0.9%Nacl沖洗液沖洗3次，濾膜在紅外燈下烘干，置2 mL二甲苯閃爍液中，測量放射強(qiáng)度，并計算得到特異性結(jié)合放射強(qiáng)度，錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS軟件One Site Competition，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出IC50及Ki值，實驗重復(fù)3次。

2.4 家兔體外血小板胞內(nèi)[Ca2+] i動員實驗 按照試劑盒說明配制染料溶液，將PRP（4×10 8個/mL）用Fluo-4 NW染料溶液稀釋100倍，然后加入96孔板中，每孔100 μL，置37 ℃孵育 30 min后，加入5 μL不同濃度樣品（0.01% DMSO助溶，用試劑盒中緩沖液配制3個化合物樣品使得終濃度為2 μmol·L-1），并分為靜息組和激活態(tài)組（激活態(tài)組加入PAF，終質(zhì)量濃度0.033 mg·L-1，靜息組不加入PAF），采用EnSPire 2300多功能酶標(biāo)儀在 37 ℃下檢測胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度，發(fā)射波長為516 nm，激發(fā)波長為494 nm，通過平均熒光強(qiáng)度比較鈣釋放率。

2.5 環(huán)核苷酸分析 制備PRP后，調(diào)整血小板密度為4×108 個/mL，與Ca2+動員實驗相同，設(shè)立靜息組與激活態(tài)組，靜息組將40 μL PRP與5 μL 3種銀杏二萜內(nèi)酯樣品及5 μL 生理鹽水37 ℃孵育5 min后，加入10 mmol·L-1 EDTA終止反應(yīng)；激活態(tài)組將生理鹽水改為PAF溶液，終止反應(yīng)后用PBS洗滌3次，之后于-80 ℃凍存，37 ℃解凍，重復(fù)3次（24 h/次），血小板懸浮液4 000×g在4 ℃離心20 min，上清液留作ELISA試劑盒測定[6-7]。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用±s表示。先用單因素方差分析（One-way ANOVA），再用Dunnett′s或Tukey′s多重比較法與對照組比較各組數(shù)據(jù)。統(tǒng)計顯著性水平P<0.01及P<0.05。

3 結(jié)果

3.1 銀杏二萜內(nèi)酯A，B，K體外給藥對家兔血小板聚集率的影響 研究結(jié)果表明，生理鹽水組與對照組相比無顯著性差異，說明DMSO不會引起血小板的聚集，可以用作藥物的溶劑。GA，GB，GK對PAF誘導(dǎo)的家兔體外血小板聚集具有有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，結(jié)果見表1，其中GK對于PAF的拮抗作用最強(qiáng)，IC50為0.5 μmol·L-1，GB（IC50=0.64 μmol·L-1）次之，GA（IC50=2.54 μmol·L-1）的作用最弱。研究結(jié)果表明3種銀杏二萜內(nèi)酯與PAF受體的親和力較強(qiáng)，為進(jìn)一步證實該結(jié)果，本實驗測定了三者與PAF受體的結(jié)合力。

3.2 銀杏二萜內(nèi)酯A，B，K對PAF與PAF受體結(jié)合的特異性拮抗作用 實驗方法參考文獻(xiàn)[4]并進(jìn)行重復(fù)，求得Kd為0.016 542 nmol·L-1，由此可計算，GK的Ki=6.47×10-3 nmol·L-1，見表2，為三者之中最小，且比GB小1個數(shù)量級，而GB比GA小1個數(shù)量級，說明GK拮抗PAF受體的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于GB和GA，此結(jié)果與三者拮抗PAF誘導(dǎo)的血小板聚集結(jié)果一致，見圖1，表明三者對家兔血小板膜上的PAF受體具有較高的親和力，其強(qiáng)弱順序為GK>GB>GA。endprint

3.3 GA，GB，GK對家兔體外血小板胞內(nèi)[Ca2+]i動員的影響 GA，GB，GK對處于靜息態(tài)的血小板胞內(nèi)[Ca2+]i無明顯影響，見圖2；經(jīng)PAF刺激后，胞內(nèi)[Ca2+]i熒光強(qiáng)度顯著增加，但在預(yù)先給予GA，GB，GK的組別中，可以觀察到，相比于PAF刺激組，三者均能夠顯著降低胞內(nèi)[Ga2+]i熒光強(qiáng)度，且其強(qiáng)弱順序和他們拮抗PAF的結(jié)果一致。

3.4 GA，GB，GK對血小板中環(huán)核苷酸含量的影響 由結(jié)果可知，在靜息狀態(tài)下，當(dāng)給予GA，GB，GK刺激后，三者均能夠明顯升高血小板中cAMP的水平；而當(dāng)靜息狀態(tài)的血小板給予PAF刺激后，血小板中的cAMP水平顯著下降，但若在給予PAF的同時加入GA，GB與GK，則三者能夠逆轉(zhuǎn)PAF導(dǎo)致的血小板中cAMP水平的下降，并且具有顯著性差異，見圖3。

4 討論

缺血性腦卒中又稱作腦梗死，是一種常見的神經(jīng)內(nèi)科疾病，具有高致殘率、高病死率等特點，在我國，腦卒中發(fā)病率為（116～219）/10萬人[8]。腦組織中局部動脈血流灌注減少或中斷，導(dǎo)致局部血栓的形成是誘發(fā)腦卒中的重要病因[9]，因而抗血小板藥物對于該類疾病治療具有良好的效果。目前公認(rèn)的抗血小板藥物有阿司匹林和氯吡格雷，它們分別對AA及ADP誘導(dǎo)的血小板聚集具有較好的抑制作用，但該類靶點并非腦卒中過程中的特異性靶點，因而使用不當(dāng)易導(dǎo)致出血性風(fēng)險[10-11]。

PAF是迄今所發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的血小板聚集誘導(dǎo)劑，是TXA2的200倍，ADP的500倍[12]，它能加速血小板聚集和顆粒釋放，增加血管通透性，并參與炎癥、血栓和氧化等病理過程，是較好的缺血性腦卒中治療靶點[13-14]。GB是已發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物中最強(qiáng)的PAF受體拮抗劑之一，含有GB的制劑對缺血性腦卒中也具有顯著的療效[15-16]。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液中具有與GB相同母核的GA和GK，應(yīng)當(dāng)具有與GB相似的拮抗PAF受體的作用，但它們各個從成分作用強(qiáng)弱如何，需要進(jìn)一步探討。通過抑制家兔體外血小板聚集實驗，本研究確認(rèn)了GA，GB，GK對PAF的拮抗作用，而通過對化合物的比較發(fā)現(xiàn)，GK對于PAF受體的拮抗作用最強(qiáng)。為進(jìn)一步驗證三者對PAF受體的拮抗作用，實驗還考察了三者與PAF受體的結(jié)合力，該結(jié)果從物理化學(xué)的角度證明GA，GB，GK通過競爭性的結(jié)合血小板膜上的PAF受體，抑制PAF與受體的結(jié)合，從而抑制血小板的聚集的物理化學(xué)基礎(chǔ)，不僅如此，其結(jié)合力的強(qiáng)弱趨勢與前期抗血小板的活性趨勢保持一致。綜上，本研究進(jìn)一步豐富了銀杏內(nèi)酯拮抗PAF受體的證據(jù)。

前述實驗證實了三者對于PAF受體的拮抗作用，為探索三者拮抗PAF受體抑制血小板聚集的作用機(jī)制，本實驗還研究了三者對于PAF激動前后血小板內(nèi)游離Ca2+濃度的改變。實驗結(jié)果表明GA，GB，GK能夠抑制PAF誘導(dǎo)的血小板中的[Ca2+]i 釋放，但對于靜息狀態(tài)的血小板無明顯作用，且GK的拮抗能力最強(qiáng)，說明三者能通過拮抗PAF受體抑制[Ca2+]i釋放。[Ca2+]i釋放是PAF受體激動后的主要生化事件，其增加后，能夠進(jìn)一步引起磷脂酶A2（PLA2）的激活、血小板形態(tài)改變、致密顆粒釋放和最終血小板的聚集等一系列級聯(lián)反應(yīng)[17]。本研究表明，銀杏二萜內(nèi)酯通過拮抗PAF受體激動，抑制[Ca2+]i釋放。不僅如此，3個化合物對[Ca2+]i的抑制趨勢與其對血小板聚集的抑制趨勢保持一致，其中GK的活性最強(qiáng)。因此，本研究表明，抑制[Ca2+]i釋放是銀杏二萜內(nèi)酯通過拮抗PAF受體抑制血小板聚集的重要機(jī)制之一。

前人的報道表明，cAMP也是PAF誘導(dǎo)的血小板聚集中的重要信號分子。具體表現(xiàn)為，PAF受體激動后，cAMP含量降低，導(dǎo)致ATP依賴的鈣離子通道脫磷酸化，進(jìn)而促使 [Ca2+]i釋放及后續(xù)的血小板反應(yīng)[18-20]。本研究圍繞銀杏二萜內(nèi)酯對靜息態(tài)（無PAF處理）和激活態(tài)（PAF處理）下血小板內(nèi)cAMP含量的影響進(jìn)行了比較，結(jié)果表明銀杏二萜內(nèi)酯可以顯著提高激活態(tài)血小板內(nèi)cAMP含量，逆轉(zhuǎn)PAF的作用。銀杏二萜內(nèi)酯對cAMP含量提高的趨勢與其對[Ca2+]i釋放的抑制趨勢保持一致，其中以GK的活性最為明顯。此外，本研究還表明，銀杏二萜內(nèi)酯盡管對靜息態(tài)血小板內(nèi)cAMP也具有顯著的誘導(dǎo)作用，但對[Ca2+]i釋放并沒有顯著影響，這也提示了血小板對Ca2+含量的調(diào)節(jié)可能還存在cAMP以外的機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)銀杏二萜內(nèi)酯A，B和K通過選擇性結(jié)合PAF受體，拮抗PAF與PAF受體的結(jié)合；在血小板內(nèi)，它們通過提高受PAF抑制的cAMP水平，進(jìn)而抑制[Ca2+]i釋放及后續(xù)的血小板聚集。本研究還發(fā)現(xiàn)GK具有比GB更強(qiáng)的拮抗PAF受體的能力，因而含有GK的銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可能會發(fā)揮出比單體化合物更優(yōu)的藥效。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint