譚 寧，杜守穎，薛宇濤，譚 麗，陸 洋，李鵬躍

立方液晶納米粒，又稱納米立方體或脂質(zhì)立方液晶納米粒是兩親性脂質(zhì)和表面活性劑在水中自發(fā)形成的雙連續(xù)的立方液晶納米分散體系，即脂質(zhì)和表面活性劑結(jié)合水形成立方液晶相，再以類似固體納米粒的形式分散在過(guò)量的水中形成分散體系[1]，是一種新型的納米制劑。水溶性藥物可以包封在類脂立方液晶的水道中，脂溶性的藥物包封在脂質(zhì)雙分子層中，兩親性分子貫穿其中[2]。目前有研究證明立方晶在靜脈、口服、口腔黏膜、陰道黏膜、經(jīng)皮給藥方面有明顯效果[3]，一些中藥中成分如丹酚酸B、姜黃素、苦參堿也可包載入液晶納米粒中[4-6]，應(yīng)用前景廣泛。本實(shí)驗(yàn)室前期已優(yōu)化了立方液晶納米粒的處方和制備工藝，通過(guò)體外鼻腔灌流、細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)證明其有明顯增加藥物吸收和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)效果。

MDCK-MDR1細(xì)胞是研究藥物跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的吸收、以及藥物間的相互作用、評(píng)價(jià)藥物安全性的一個(gè)較為理想的體外模型，可用于模擬血腦屏障模型[7-9]。納米粒子入胞有不同途徑，包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞、細(xì)胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)內(nèi)吞、大胞飲和非網(wǎng)格蛋白-非細(xì)胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)內(nèi)吞，其中前3種內(nèi)吞途徑是納米粒子入胞的主要內(nèi)吞途徑[10]。與脂溶性藥物相比，水溶性藥物不易進(jìn)入細(xì)胞。為考察液晶納米粒是否可增加水溶性物質(zhì)透過(guò)MDCK-MDR1細(xì)胞的能力，以及確定液晶納米粒進(jìn)入細(xì)胞的通路。本實(shí)驗(yàn)采用鈣黃綠素作為水溶性標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)，考察液晶納米粒的攝取及攝取機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 細(xì)胞株 MDCK-MDR1細(xì)胞，由浙江大學(xué)曾蘇教授惠贈(zèng)。

1.2 藥物與試劑 鈣黃綠素（Calcein，Aladdin）、單油酸甘油酯（浙江嘉興瑪雅試劑）、泊洛沙姆407（北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司）、甘油（北京化工廠，分析純）、維生素 E 醋酸酯（Adamas-beta，99%）；非律平（Filipin，Harvy Bio）、細(xì)胞松弛素 D（Phytoalexins D，Aladdin）、氯丙嗪（CPZ，Sigma）、2-去氧-D-葡萄糖（2-D G，Alfa Aesar）；胎牛血清（F BS，Gib－co）、DMEM培養(yǎng)基（Macgene）、0.25%胰蛋白酶（Macgene）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，Amresco）、Hank’s平衡鹽溶液（HBSS，Invitrogen）。

1.3 主要儀器 RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；電子分析天平（Sartorius BT 125D型，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（seriesⅡ型，Thermo）；流式細(xì)胞儀（FACSCantoⅡ型，BD）；倒置顯微鏡（CKX－41 型，Olympus）。

2 方法

2.1 鈣黃綠素液晶納米粒（Cal－LCNPs）的制備 選用薄膜分散法制備液晶納米粒。將處方量鈣黃綠素溶解在甘油-水中，作為水相；處方量的甘油單油酸酯（GMO）等油相，采用薄膜分散法均勻涂布在圓底燒瓶玻璃壁內(nèi)表面。將水相倒入圓底燒瓶中，加玻璃珠后，旋轉(zhuǎn)水合得到250μg/mL鈣黃綠素液晶納米粒溶液。得到的葛根素液晶納米粒包封率用紫外-分光光度計(jì)測(cè)定包封率可達(dá)94.28%。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) MDCK-MDR1細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，置于 CO2培養(yǎng)箱（37℃），5%CO2，相對(duì)濕度 95%條件下培養(yǎng)。隔日更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%以上匯合時(shí)，以0.25%胰酶消化，按1∶3傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 溶液的配制 用空白HBSS溶解鈣黃綠素制備成 1、5、10、20、25、40、50 μg/mL 溶液為 Cal組；HBSS 將 Cal-LCNPs分別稀釋 5、10、20、25、50、100 倍為Cal-LCNPs組。

2.3.2 MTT法 MTT法原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性黃色可溶性MTT[3-（4，5-二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽]還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值（OD值）[11]。常規(guī)條件下分別培養(yǎng)MDCK-MDR1細(xì)胞至70%～80%匯合時(shí)，消化細(xì)胞，以DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）終止消化，用移液器輕輕吹打后，離心棄去上清液，再加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基，制得單個(gè)細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL。培養(yǎng)24 h后，按照上述分組方式給藥。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT溶液20μL，37℃孵育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲臜充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔OD值，記錄結(jié)果。選取細(xì)胞存活率≥95%的藥物濃度用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)[9]。

2.4 Cal-LCNPs的MDCK-MDR1細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)至80%～90%匯合的細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后DMEM培養(yǎng)基稀釋成密度4×105個(gè)/mL接種于12孔板。置于37℃，5%CO2條件下常規(guī)。生長(zhǎng)24 h后細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次后，37℃的HBSS孵育15 min，然后每組分別加入0.5 mL的Cal-LCNPs HBSS稀釋溶液和10μg/mL Cal HBSS溶液，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于 0.5、1、1.5、2 h 吸棄未吸收的藥液，用冷的PBS洗3次后，每孔加0.25 mL胰酶培養(yǎng)箱中消化；待細(xì)胞消化完全后，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min；棄去上清液，細(xì)胞用0.5 mLHBSS稀釋，吹打。處理好的樣品立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣黃綠素的熒光強(qiáng)度，繪制曲線，比較兩組吸收情況。鈣黃綠素的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為497 nm和518 nm。

2.5 Cal-LCNPs的MDCK-MDR1細(xì)胞攝取機(jī)制實(shí)驗(yàn) 采用通路抑制劑法研究MDCK-MDR1對(duì)立方液晶納米粒的攝取機(jī)制。將生長(zhǎng)至80%～90%匯合的細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后DMEM培養(yǎng)基稀釋成密度4×105個(gè)/mL接種于12孔板。置于37℃，5%CO2條件下常規(guī)24 h培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)基換成含通路抑制劑的HBSS，培養(yǎng)0.5 h，各組溶液濃度為10μg/mL非律平、2μmol/L細(xì)胞松弛素D、10μg/mL氯丙嗪、50 mmol/L 2-D-去氧葡萄糖，空白對(duì)照組加入空白HBSS。0.5 h后加入含Cal-LCNPs的培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。采取2.4項(xiàng)下相同方法消化、離心、稀釋、吹打。處理好的樣品立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣黃綠素的熒光強(qiáng)度。研究數(shù)據(jù)經(jīng)SAS8.2軟件處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 如圖1所示，在實(shí)驗(yàn)選取的鈣黃綠素濃度范圍1～50μg/mL，Cal-LCNPs稀釋25倍（Cal濃度約10μg/mL）以上對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞無(wú)毒性。所以，選取10μg/mLCal溶液及Cal-LCNPs稀釋25倍進(jìn)行細(xì)胞攝取及機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)。

3.2 MDCK-MDR1 對(duì) Cal，Cal-LCNPs的攝取結(jié)果 由圖2中攝取曲線可見(jiàn)，在相同濃度下，MDCKMDR1 2 h內(nèi)細(xì)胞對(duì)Cal-LCNPs胞內(nèi)攝取量明顯多于對(duì)Cal的攝取。以時(shí)間為自變量，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度為因變量，將2個(gè)攝取曲線進(jìn)行方程擬合發(fā)現(xiàn)，Cal攝取符合零級(jí)方程（Y=31t+73.833，r=0.966 4），Cal-LCNPs攝取符合一級(jí)方程[Ln（Y）＝0．289 3t+4.348 1，r=0.925 1]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示立方液晶納米粒不僅可以增加MDCK-MDR1對(duì)Cal的攝取也可改變細(xì)胞的攝取行為。

圖1 MDCK-MDR1細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Fig.1 MTT test resultsof MDCK-MDR1 cells(n=5)

圖2 MDCK-MDR1細(xì)胞對(duì)Cal、Cal-LCNPs攝取曲線（n=3）Fig.2 Uptakecurvesof Cal and Cal-LCNPsin MDCK-MDR1 cells（n=3）

3.3 MDCK-MDR1對(duì)Cal-LCNPs的攝取機(jī)制考察 在含通路抑制劑的組別中，經(jīng)過(guò)氯丙嗪（CPZ）、2-去氧葡萄糖（2-DG）孵育過(guò)的細(xì)胞內(nèi)含熒光比空白組少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。證明細(xì)胞攝取機(jī)制與氯丙嗪和2-D-去養(yǎng)葡萄糖抑制通路有關(guān)。見(jiàn)圖3。

3 討論

圖3 MDCK-MDR1細(xì)胞對(duì)含不同通路抑制劑的Cal-LCNPs溶液攝取（n=3）Fig.3 Uptake of Cal-LCNPs in MDCK-MDR1 cells treated with different inhibitors（n=3）

MDCK-MDR1細(xì)胞系是由MDCK細(xì)胞經(jīng)人源MDR1轉(zhuǎn)染得到，是一種極性過(guò)表達(dá)P-gp的細(xì)胞系，和血腦屏障的外排作用非常類似，因而可利用MDCK-MDR1細(xì)胞作為血腦屏障藥物透過(guò)的快速篩選模型。一些由載體介導(dǎo)的藥物可以利用MDCK-MDR1細(xì)胞系，將其與被動(dòng)擴(kuò)散的物質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)。在細(xì)胞單層膜實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)立方液晶納米?？擅黠@提高水溶性藥物葛根素的細(xì)胞吸收率。研究中細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)又得到液晶納米?？赏ㄟ^(guò)胞內(nèi)途徑增加吸收，并改變了入胞方式的結(jié)論。這提示小分子水溶性藥物可以通過(guò)立方液晶納米粒包裹改變?nèi)氚緩?，提高入胞能力。該結(jié)論為研究載有水溶性藥物立方液晶納米粒的細(xì)胞遞送過(guò)程提供參考和依據(jù)。微粒的內(nèi)吞為能量依賴過(guò)程[12]。2-DG是細(xì)胞無(wú)法利用的碳源，50 mmol/L時(shí)可阻斷糖酵解。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)2-DG與細(xì)胞孵育后與空白組相比，攝取能力減弱（P＜0.05），證明細(xì)胞攝取液晶納米粒是內(nèi)吞的能量依賴過(guò)程。

在細(xì)胞攝取納米制劑的4種通路類型中，細(xì)胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)內(nèi)吞將載體遞送至pH條件和生物條件緩和的小窩體內(nèi)然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和胞漿中[13]。非律平是常用的小窩蛋白抑制劑，可抑制小窩蛋白形成從而抑制該途徑。大胞飲指在某些因素刺激下，細(xì)胞膜皺褶形成大且不規(guī)則的原始內(nèi)吞小泡，它們被稱為大胞飲體。通常大胞飲作用能顯著地被細(xì)胞松弛素和秋水仙堿抑制，被抑制的微管和微絲在這個(gè)過(guò)程中扮演重要角色[14]。其中細(xì)胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)內(nèi)吞可避免溶酶體內(nèi)聚集[15-16]。但本實(shí)驗(yàn)研究證明當(dāng)10μg/mL非律平、2μmol/L細(xì)胞松弛素D的參與抑制了2種途徑后，細(xì)胞內(nèi)攝取的熒光強(qiáng)度和空白對(duì)照組相比并未明顯降低，這證明液晶納米粒并非通過(guò)細(xì)胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)或者大包飲途徑進(jìn)入細(xì)胞。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是各類納米顆粒內(nèi)吞的主要途徑，在細(xì)胞膜表面存在附有網(wǎng)格蛋白包被的小窩和小泡，與相應(yīng)配體（被內(nèi)吞的分子）結(jié)合形成復(fù)合物后集中到細(xì)胞內(nèi)面有網(wǎng)格蛋白的質(zhì)膜區(qū)，形成小窩，凹陷，最終與質(zhì)膜脫離進(jìn)入細(xì)胞漿，形成內(nèi)體。早期內(nèi)體成熟成為晚期內(nèi)體，最后和其余內(nèi)吞或溶酶體融合[17]。氯丙嗪可與核內(nèi)體作用，使其脫落，從而阻斷該途徑。結(jié)果顯示液晶納米粒是以此途徑進(jìn)入細(xì)胞。提示液晶納米粒載藥進(jìn)入細(xì)胞后可能會(huì)與溶酶體結(jié)合，這為之后液晶納米粒制劑設(shè)計(jì)及給藥途徑選擇提供依據(jù)。

立方液晶納米粒與傳統(tǒng)脂質(zhì)體相比具有穩(wěn)定性好、包封率高、雙分子層面積大、可無(wú)限稀釋等優(yōu)勢(shì)[18]。有報(bào)道稱[19]，它既能夠包結(jié)水溶性藥物如四環(huán)素、馬來(lái)酸噻嗎洛爾、頭孢唑啉等，也能包結(jié)油溶性藥物如阿司匹林和維生素E等。其他的一些藥物如溴丙胺太林、甲硝唑、馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸普萘洛爾以及蛋白質(zhì)類藥物血紅蛋白和胰島素也能包結(jié)在立方液晶中。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示立方液晶納米粒因其可改變水溶性藥物進(jìn)入細(xì)胞的方式、影響細(xì)胞吸收，在中藥水溶性成分遞藥系統(tǒng)中具有良好應(yīng)用前景。

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