王曉楠,程民,胡世蓮

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所，腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽省循證醫(yī)學(xué)中心,合肥 230001)

在惡性腫瘤中，肺癌的發(fā)病率和病死率居于首位[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌初診患者中約40%存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，根治性手術(shù)治療后亦有30%～60%的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。目前肺癌的臨床診斷與治療技術(shù)已經(jīng)達(dá)到了相當(dāng)完備的水平，但肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是阻礙患者生存期提高的主要原因。近些年，新的檢測(cè)手段和治療方法使肺癌患者的預(yù)后得到改善，但仍難以達(dá)到早期確診，早期治療。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是一個(gè)多階段、多步驟的復(fù)雜過程，其中腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要一步。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)來自原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶腫瘤脫落進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[3]。臨床研究表明，CTCs參與腫瘤血行轉(zhuǎn)移過程，進(jìn)入外周血后絕大部分CTCs在短期內(nèi)死亡，只有極少部分CTCs可以在血液中存活，它們具有高度活性、高度轉(zhuǎn)移潛能、自我增殖能力，并且可以通過聚集形成微小癌栓，在適宜的條件下發(fā)展成微小轉(zhuǎn)移灶。因此，在血液中檢測(cè)到CTCs提示腫瘤形成或已經(jīng)發(fā)生了擴(kuò)散或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。

早在1896年，澳大利亞學(xué)者Ashworth在一個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的尸檢報(bào)告中首次提出了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的概念，他發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的血液中存在腫瘤細(xì)胞，并定義為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。這些細(xì)胞存在于外周血、淋巴、骨髓中，在一定的條件下增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[5]。許多患者在術(shù)中并未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但不久之后腫瘤復(fù)發(fā)，可能與血液中或淋巴組織中的微小轉(zhuǎn)移灶有關(guān)。有研究表明CTCs可作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷[6]。通過檢測(cè)外周血中CTCs，可以對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進(jìn)行早期診斷，并采取積極的治療措施，有助于延長(zhǎng)患者生存期、提高患者生存質(zhì)量。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性

1.1 CTCs具有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換(MET)能力 EMT是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，而間質(zhì)細(xì)胞具有如運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)、侵襲性高、抗凋亡能力等特性。當(dāng)腫瘤細(xì)胞由原發(fā)灶轉(zhuǎn)移至繼發(fā)灶時(shí)，CTCs經(jīng)歷了EMT轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)，血管增多以及細(xì)胞存活能力增強(qiáng)[7]。

EMT參與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移可通過以下三種方式：減弱細(xì)胞間的聯(lián)系，降解細(xì)胞基質(zhì)以及修飾細(xì)胞骨架。上皮細(xì)胞之間及上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間分別通過整合蛋白和鈣連接蛋白緊密相連，然后再通過細(xì)胞角蛋白和膠原蛋白加強(qiáng)這種聯(lián)系。當(dāng)腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤細(xì)胞失去了正常上皮細(xì)胞間的相互作用，表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的特征，即EMT，腫瘤細(xì)胞更容易侵入血管內(nèi)皮進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]。在EMT過程中，上皮細(xì)胞表達(dá)的上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、E-cadherin和細(xì)胞角蛋白(CK)下調(diào)，而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物如波形蛋白和N-神經(jīng)鈣黏素上調(diào)[9]。通過EMT，參與細(xì)胞間的緊密連接和黏附的分子表達(dá)降低，同時(shí)以波形蛋白為主的細(xì)胞骨架發(fā)生轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞間黏附作用下降，運(yùn)動(dòng)能力增加，從而促使單個(gè)腫瘤細(xì)胞從腫瘤組織中脫落游走遷移至血管。此外，EMT還可產(chǎn)生促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)[10]，通過MMP的作用對(duì)細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行降解，促進(jìn)CTCs從腫瘤組織上皮表面釋放，便于CTCs滲透入血管[11]。

CTCs也可出現(xiàn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物共表達(dá)，提示EMT和MET間可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[12]，作為與EMT相反的生理過程，MET可增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附性，減弱細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力從而增強(qiáng)細(xì)胞的定植能力，還能促進(jìn)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變，因此CTCs在進(jìn)行EMT的同時(shí)還可能發(fā)生MET，MET為CTCs的遠(yuǎn)處定植及建立轉(zhuǎn)移提供便利條件。

1.2 CTCs聚集形成循環(huán)腫瘤微栓 進(jìn)入到外周血液中的CTCs具有不同細(xì)胞類型，有上皮細(xì)胞表型、上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞混合表型、間質(zhì)細(xì)胞表型等[13]，其中以間質(zhì)細(xì)胞表型CTCs轉(zhuǎn)移潛能最高。也可根據(jù)存在形式分為單個(gè)細(xì)胞(CTC)及聚集成團(tuán)的循環(huán)腫瘤微栓(CTM)，其中以CTM的轉(zhuǎn)移潛能最強(qiáng)。

CTM又稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞集群(CTC clusters)。CTCs通常以單個(gè)細(xì)胞游走于血液循環(huán)中，侵入循環(huán)系統(tǒng)的CTCs受到血液物理作用的破壞以及機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的吞噬殺傷作用，極少數(shù)可以在血液中存活，通過相互聚集成CTM發(fā)揮抗吞噬作用，從而提高存活能力[14]。研究表明，CTM腫瘤播散能力是CTCs的50倍以上，這可能與CTM具有抗凋亡能力，CTM中異質(zhì)性細(xì)胞的相互作用，以及免疫耐受等作用有關(guān)[15]。

CTM是由一些CTC和非腫瘤細(xì)胞(輔助細(xì)胞)構(gòu)成，其中輔助細(xì)胞包括上皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞，免疫細(xì)胞，血小板和一些纖維母細(xì)胞等。輔助細(xì)胞可以為腫瘤細(xì)胞生存提供支持，如纖維母細(xì)胞等，可以增加CTCs集群的穩(wěn)定性，便于形成轉(zhuǎn)移灶，當(dāng)去除CTM中部分纖維母細(xì)胞后，CTCs轉(zhuǎn)移播散能力明顯下降[16]。與單個(gè)CTCs相比，盡管CTM含量更少，但是CTM是腫瘤細(xì)胞的“集體遷移”結(jié)果，其抗凋亡能力更高、增殖能力更強(qiáng)以及具有逃避免疫殺傷能力從而具備更高的轉(zhuǎn)移潛能[17]。有研究顯示：CTM的轉(zhuǎn)移能力和耐藥性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單個(gè)CTC[18]。

1.3 CTCs具有腫瘤干細(xì)胞(CSC)特性 腫瘤干細(xì)胞理論是在干細(xì)胞理論假說的基礎(chǔ)上提出來的。根據(jù)腫瘤干細(xì)胞理論：腫瘤細(xì)胞來源于基因突變的干細(xì)胞，具有無限分化增殖能力，并且能侵入到其他組織并擴(kuò)散到全身各處[19-21]。

CSC是一類具干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，可以長(zhǎng)期存活，同時(shí)具有很強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)和遷移能力。CTCs存在于腫瘤患者血液循環(huán)中，可能是作為CSC的一種特殊類型，具有一定的干細(xì)胞特性，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[22]。但并不是所有的CTCs都能發(fā)生轉(zhuǎn)移，只有極少部分類似于干細(xì)胞特性的CTCs才能存活并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處形成繼發(fā)病灶，這些細(xì)胞稱為循環(huán)腫瘤干細(xì)胞，具有自我更新、增殖的潛能，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

2 CTCs的檢測(cè)技術(shù)

Steinert等[23]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤病人每天每克原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶約有106個(gè)CTCs脫落進(jìn)入外周血液中，而90%的CTCs通過血液物理作用、免疫損傷和凋亡而失去活力。CTCs在血液中含量極少，CTCs與正常血細(xì)胞的比值為(1/107)～(1/108)[24]，因此難以用常規(guī)的方法提取足夠量的CTCs，這限制了CTCs在臨床中的應(yīng)用。

CTCs檢測(cè)分為富集及鑒定兩個(gè)步驟。富集是指利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)或免疫學(xué)方法分選出腫瘤細(xì)胞。一種方法是利用血細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的形態(tài)學(xué)差異來分離CTCs，優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞結(jié)構(gòu)不被破壞，分離后的腫瘤細(xì)胞可接著進(jìn)行免疫組織化學(xué)等方面的研究，此方法缺點(diǎn)是特異性較差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，較少用；還有一種方法是采用免疫學(xué)方法進(jìn)行分離：大部分來源于上皮的腫瘤細(xì)胞都表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)以及細(xì)胞角蛋白(CK)等抗原，而血液中來源于骨髓的細(xì)胞則表達(dá)CD45等分子[25]。利用磁珠特異性結(jié)合抗原分選的方法，可從外周血中將CTCs分離富集出來。鑒定是指利用腫瘤表面或細(xì)胞核內(nèi)特異性標(biāo)志物對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和特征分析。目前CTCs的鑒定有三種方法：一是于核酸檢測(cè)技術(shù)，即反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)；二是熒光顯微技術(shù)；三是細(xì)胞免疫標(biāo)記技術(shù)。核酸檢測(cè)技術(shù)是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出腫瘤細(xì)胞相關(guān)的特異性標(biāo)志物來證實(shí)腫瘤細(xì)胞的存在，該方法敏感度及特異度均較高，但是不足之處是假陽(yáng)性率高，取血時(shí)容易受到上皮細(xì)胞的污染[26]。熒光顯微技術(shù)是指抗體經(jīng)過熒光標(biāo)記處理與特異性抗原結(jié)合，在顯微熒光鏡下可以直接觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞免疫標(biāo)記采用抗原抗體結(jié)合的方法鑒定CTCs，利用腫瘤細(xì)胞表達(dá)的一些特異性分子抗原，相比核酸檢測(cè)技術(shù)，細(xì)胞免疫標(biāo)記是基于細(xì)胞內(nèi)部特異性抗原的表達(dá)，敏感性低于RT-PCR。

因此為了提高敏感度和特異性，更加準(zhǔn)確地分離并檢測(cè)分析CTCs，集富集、檢測(cè)和分析與一體的綜合系統(tǒng)逐漸應(yīng)用于臨床，如CellSearch系統(tǒng)、CTCs芯片(CTCs-chip)。CellsearchTM系統(tǒng)已通過美國(guó)食品和藥物監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證，可從7.5 mL的外周血中檢測(cè)到單一的腫瘤細(xì)胞[27]。此系統(tǒng)采用EpCAM抗體磁珠進(jìn)行富集后，在外加強(qiáng)力磁場(chǎng)的作用下從血液中提取CTCs，并對(duì)分離出來的CTCs進(jìn)行通透、固定，然后用DAPI熒光核染料、CD45熒光抗體和CK8/CK18/CK19熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞，最后采用半自動(dòng)四色熒光顯微鏡Cell-Spotter Analyzer檢測(cè)分析篩選出CK8+/18+/19+、DAP1+、CD45-的細(xì)胞為CTCs。該方法可從400多億個(gè)血細(xì)胞中檢測(cè)到稀少的CTCs，目前已應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌等外周血的CTCs檢測(cè)，敏感性和特異性較高，但是檢測(cè)費(fèi)昂貴，尚不能大規(guī)模推廣。

3 CTCs在肺癌診療中的研究進(jìn)展

3.1 肺癌的早期診斷 近些年，在影像學(xué)檢查不能明確的情況下，腫瘤標(biāo)志物對(duì)疾病嚴(yán)重程度的診斷評(píng)估起到重要作用，如PSA、AFP和CEA。然而仍有許多惡性腫瘤不具有可靠的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，缺乏腫瘤診斷特異性標(biāo)志物，加上目前技術(shù)的限制，導(dǎo)致其敏感性和特異性不高。此外，許多蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在血液循環(huán)中持續(xù)存在數(shù)周，因此需數(shù)周或數(shù)月后才能得到準(zhǔn)確評(píng)估[28]。外周血中CTCs的含量水平與腫瘤分化程度和腫瘤大小密切相關(guān)，水平越高，患者預(yù)后相對(duì)越差。在肺癌形成和轉(zhuǎn)移的早期，如果在外周循環(huán)中檢測(cè)到脫落的CTCs，可以達(dá)到早發(fā)現(xiàn)，早診斷，并針對(duì)性治療。CTCs檢測(cè)相對(duì)于病理活檢達(dá)到了相對(duì)無創(chuàng)，被稱為“液態(tài)活檢”。Tanaka等[29]利用CellSearch系統(tǒng)比較125例肺癌和25例良性腫瘤的CTCs陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)肺癌(30.6%)的陽(yáng)性率明顯高于良性腫瘤的陽(yáng)性率(12%)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)晚期以及發(fā)生肺癌轉(zhuǎn)移患者的CTCs含量明顯增高。接著研究人員通過檢測(cè)患者外周血CTCs的數(shù)量來鑒別原發(fā)肺腫瘤和肺部良性疾病，采用受試者工作特征(ROC)曲線將癌胚抗原(CEA)和CTCs的診斷價(jià)值進(jìn)行比較，研究結(jié)果顯示：在鑒別肺癌和肺良性疾病方面，CTCs的診斷價(jià)值尚不如CEA(CTCs檢測(cè)ROC曲線下面積為0.598、CEA檢測(cè)ROC曲線下面積為0.747)，但是CTCs在預(yù)測(cè)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面有一定優(yōu)勢(shì)，其特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為83.0%、89.7%，可見CTCs預(yù)測(cè)價(jià)值高于CEA。因此，監(jiān)測(cè)CTCs特異性的改變可作為檢測(cè)早期肺癌和有效治療后殘留灶復(fù)發(fā)的指標(biāo)，有利于治療決策[30]。

3.2 病情監(jiān)測(cè)指導(dǎo)個(gè)體化治療 目前對(duì)肺癌患者病情監(jiān)測(cè)的主要手段有影像學(xué)檢查，腫瘤標(biāo)志物等血清學(xué)檢查以及臨床表現(xiàn)，然而目前的手段難以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的變化。相比穿刺或者手術(shù)獲取肺癌標(biāo)本，CTCs的檢測(cè)具有實(shí)時(shí)性、相對(duì)無創(chuàng)性。可通過CTCs對(duì)肺癌患者病情進(jìn)行監(jiān)測(cè)并且指導(dǎo)治療方案的制定及更換，甚至對(duì)手術(shù)效果以及化療進(jìn)行評(píng)價(jià)。在NSCLC(非小細(xì)胞肺癌)中，原發(fā)灶標(biāo)本檢測(cè)EGFR呈陰性，在病情惡化后，有些患者外周血CTCs可以檢測(cè)到EGFR發(fā)生突變，而使用靶向藥物吉非替尼治療后，可以有效延長(zhǎng)患者生存期，提高生活質(zhì)量[31]。Carter等[32]研究顯示，外周血CTCs的檢測(cè)可以預(yù)測(cè)小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者對(duì)治療的應(yīng)答情況。研究人員在對(duì)31名小細(xì)胞肺癌患者的血液中分離CTCs進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在外周血檢測(cè)到CTCs的基因改變與患者的化療耐藥有關(guān)，對(duì)外周血CTCs的檢測(cè)可以作為化療前預(yù)測(cè)小細(xì)胞肺癌患者對(duì)化療藥物是否敏感的生物學(xué)標(biāo)志物。因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)CTCs的數(shù)目和分子特性可以有效反映患者病情變化，及時(shí)調(diào)整治療方案，達(dá)到個(gè)體化治療。

3.3 療效評(píng)估和預(yù)后判斷 腫瘤的組織學(xué)類型、TNM分期、以及臨床特征目前是對(duì)腫瘤患者進(jìn)行預(yù)后判斷的主要依據(jù)，然而CTCs的含量水平與腫瘤生存期具有明顯相關(guān)性，可以利用CTCs這一優(yōu)勢(shì)對(duì)肺癌等腫瘤患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估。Hofman等[33]進(jìn)行的一項(xiàng)大樣本前瞻性研究顯示，術(shù)前檢測(cè)CTCs數(shù)目可用來預(yù)測(cè)行根治性肺癌手術(shù)切除的Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者的無疾病進(jìn)展期(DFS)與總體生存時(shí)間(OS)，對(duì)于術(shù)前CTCs>50個(gè)的患者其無疾病進(jìn)展期(DFS)要更短一些，具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。Muinelo-Romay等[34]納入43例NSCLC患者研究發(fā)現(xiàn)治療前、化療2周后、化療5周后的CTCs水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)治療前CTCs計(jì)數(shù)為(18.9±14.8)/7.5 mL，化療后明顯降低，分別為(0.87±0.22)/7.5 mL、(0.77±0.42)/7.5 mL。此外，治療前CTCs≥5/7.5 mL的患者較CTCs<5/7.5 mL患者無進(jìn)展生存期(PFS) (4.1個(gè)月，95%CI2.2～6；7.6個(gè)月，95%CI5.7～9.5) 及總生存率(OS)更短(4.6個(gè)月,95%CI2.5～6.8 ；10.7個(gè)月,95%CI8.6～12.8)。因此，通過監(jiān)測(cè)肺癌患者外周血CTCs含量水平變化對(duì)病情療效判斷以及預(yù)后評(píng)估。

4 總結(jié)

CTCs通過腫瘤原發(fā)灶中脫落經(jīng)歷EMT過程進(jìn)入脈管系統(tǒng)，通過血管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，克服循環(huán)系統(tǒng)中物理作用和各種免疫殺傷作用形成新的微小轉(zhuǎn)移灶并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官的微血管，再?gòu)难褐袧B出，經(jīng)過MET轉(zhuǎn)變，在新的組織環(huán)境中存活，擴(kuò)散最終形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。EMT-MET理論解釋腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的過程，EMT及其相關(guān)分子參與到CTCs的許多生理步驟，深入研究CTCs以及CTM生理過程及其機(jī)制對(duì)于尋找新治療靶點(diǎn)，優(yōu)化臨床治療方案，預(yù)后評(píng)估等方面均有重要意義。

腫瘤防治的關(guān)鍵是“三早”，即早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。早期治療不僅可以節(jié)約醫(yī)療費(fèi)用，減少病人創(chuàng)傷，延長(zhǎng)病人壽命，提高生活質(zhì)量。因此，探尋可以早期診斷并能預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的檢測(cè)方法對(duì)于提高腫瘤患者生存率、改善預(yù)后至關(guān)重要。CTCs的濃度能實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)反映疾病的進(jìn)程，可用于肺癌的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)、評(píng)估預(yù)后。CTCs的檢測(cè)易獲取、可重復(fù)、相對(duì)無創(chuàng)，被稱為“液體活檢”。通過對(duì)外周血液中CTCs數(shù)量及類型檢測(cè)，監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)進(jìn)展，進(jìn)行療效評(píng)估，甚至可以對(duì)CTCs進(jìn)行基因檢測(cè)，指導(dǎo)肺癌個(gè)體化治療。雖然CTCs檢測(cè)具有很好的臨床應(yīng)用前景，但目前仍存在問題：雖已證實(shí)檢測(cè)出CTCs與腫瘤預(yù)后具有一定的相關(guān)性，但是檢測(cè)出CTCs并不代表腫瘤一定會(huì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因此需要尋找高轉(zhuǎn)移潛能的CTCs亞群；研發(fā)出更高敏感性和特異性的檢測(cè)技術(shù)仍是應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵；采用簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉的方法，將有助于CTCs的檢測(cè)盡快進(jìn)入臨床。

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