鄧彩赟，蔣成君

(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023)

姜黃素(curcumin)是從姜科植物姜黃(CurcumalongaL.)中提取的一種天然藥物，具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽和抗氧化等多種藥理活性[1]，安全性良好。在世界某些國家或地區(qū)已被使用了數(shù)百年，尤其是在印度和中國。在印度古老的阿育吠陀醫(yī)學(xué)體系中，姜黃被粉碎成糊狀物，用于包扎傷口、治療眼睛感染、燒傷、蚊蟲叮咬及各種皮膚病，也以不同的形式治療牙科疾病，以及消化不良、腸胃氣脹、潰瘍等消化系統(tǒng)疾病[2]。

姜黃素在酸性或中性環(huán)境下，主要是以β-二酮的形式存在；在堿性環(huán)境下，主要是以酮-烯醇的形式存在[3]。姜黃素難溶于水，在水中的溶解度僅為8.7 mg/L[4]，在堿性環(huán)境中的水溶性雖有所提高，但穩(wěn)定性降低。目前，姜黃素的難溶性是制約姜黃素成藥的關(guān)鍵。改善姜黃素的溶解度和生物利用度的方法主要是制備新的藥物劑型，如微乳、微球、固體分散體、脂質(zhì)體、磷脂復(fù)合物、膠束納米粒、環(huán)糊精包合物和滴丸[4-6]。然而，微球、固體分散體、脂質(zhì)體、納米粒等需要大量的載體輔料；微乳制劑含有大量表面活性劑，具有潛在毒性；制備磷脂復(fù)合物時(shí)需要在一定溫度下藥物與磷脂進(jìn)行復(fù)合反應(yīng)并除去溶劑，這樣可能引起姜黃素的降解。藥物共晶是指一個(gè)共晶形成物作為藥物活性成分 (active pharmaceutical ingredient，API)與另一個(gè)或多個(gè)共晶形成物 (cocrystal coformers，CCF) 在氫鍵、范德華力或其他非共價(jià)鍵的作用下形成新的結(jié)晶[7-8]。藥物共晶技術(shù)可以通過引入CCF改變API的諸多理化性質(zhì)，如提高生物利用度、改善穩(wěn)定性和降低成型熔點(diǎn)等[9-10]。更為重要的是，CCF以氫鍵等非共價(jià)鍵方式與API形成超分子共晶化合物后，還可提高原有藥物活性分子的藥理活性，進(jìn)而為開發(fā)更具臨床應(yīng)用價(jià)值的新型藥物提供一個(gè)新的解決途徑。

共晶最常見的合成方法為溶液法和研磨法。溶液法包括揮發(fā)結(jié)晶法、反應(yīng)結(jié)晶法和冷卻結(jié)晶法。藥物共晶若需要滿足單晶X射線衍射測試的要求，則只能通過溶液法合成，例如，姜黃素-賴氨酸共晶[11]、姜黃素-間苯三酚共晶[12]等。研磨法借助于機(jī)械力的作用來制備共晶，操作簡單、綠色環(huán)保，可以解決在溶液結(jié)晶期間可能形成的溶劑/水夾雜物等問題[13]，例如，姜黃素與煙酰胺、阿魏酸、對苯二酚等共晶[14]。研磨時(shí)固體與固體的反應(yīng)能力取決于2種分子的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性和移動性。若加入少量適當(dāng)?shù)娜軇┹o助研磨，則可以加快分子的擴(kuò)展，提高共晶的生成速率[15]，例如，姜黃素與間苯二酚、鄰苯三酚共晶[16]?；谏鲜銮闆r，本研究以鄰苯二酚(catechol)為共晶形成物，通過研磨法制備了一個(gè)未見報(bào)道的新型藥物共晶C21H20O6·C6H6O2，并用溶劑法得到規(guī)整的晶型，進(jìn)一步對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。

1 試 驗(yàn)

1.1 藥品與儀器

藥品為：姜黃素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%，安耐吉化學(xué))；鄰苯二酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，安耐吉化學(xué))。

儀器為：STA449F3同步熱分析儀(德國耐馳儀器公司)；Ultima Ⅳ系列X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；VERTEX 70紅外光譜儀(德國Bruker公司)；SU1510掃描電子顯微鏡(日本日立高新技術(shù)公司)。

1.2 試驗(yàn)過程

1.2.1 姜黃素-鄰苯二酚共晶制備

姜黃素與鄰苯二酚按摩爾比1∶1投料，準(zhǔn)確稱量姜黃素(1.842 g,5 mmol)和鄰苯二酚(0.551 g,5 mmol)，依次加入研缽中，室溫研磨15～20 min，得到姜黃素-鄰苯二酚共晶粉末，烘干。

1.2.2 差示掃描量熱法測試

取姜黃素、鄰苯二酚和姜黃素-鄰苯二酚共晶粉末各10 mg，以空白坩堝為參比，升溫速率5 ℃/min，測試溫度范圍50～300 ℃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下測試。

1.2.3 粉末X射線衍射

采用Ultima Ⅳ系列X射線衍射儀，射線源為 Cu/Kα(λ=0.154 nm)，掃描范圍為5°～60°(2θ，θ為衍射角)，掃描步長為0.02°，掃描速度為4°/min，電源設(shè)置為40 kV、40 mA。

1.2.4 傅里葉紅外光譜測試

分別取姜黃素、鄰苯二酚和姜黃素-鄰苯二酚共晶粉末微量，與溴化鉀混合在瑪瑙研缽中碾磨均勻，并壓成透明的片狀用于測試。樣品的掃描范圍為 4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.2.5 共晶制備溶劑篩選

將姜黃素-鄰苯二酚共晶粉末分別溶于以下25種有機(jī)溶劑中：乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氫呋喃、乙醇+苯(1∶1；1∶2)、甲醇+苯(1∶1；1∶2)、丙酮+苯(1∶1)、 乙醇+甲苯(1∶1)、甲醇+甲苯(1∶1)、丙酮+甲苯(1∶1)、丙酮+水(1∶1)、丙酮+二氯甲烷(1∶1)、二氯甲烷+石油醚(1∶1)、乙酸乙酯+四氫呋喃(1∶1)、乙酸乙酯+水(1∶1；1∶2)、乙酸乙酯+苯(1∶1；1∶2)、乙腈+二氯甲烷(1∶1；1∶2)。共晶粉末完全溶解后置于室溫下，待有機(jī)溶劑揮發(fā)，觀察是否有晶體析出。

1.2.6 電子顯微鏡掃描

分別取少量姜黃素-鄰苯二酚共晶粉末和有機(jī)溶劑中析出的共晶，附在導(dǎo)電雙面粘合膠帶上進(jìn)行噴金，在5.0 kV電壓下獲得不同放大倍數(shù)的掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)照片。

2 結(jié)果與討論

2.1 姜黃素-鄰苯二酚共晶制備

圖1 固體顏色變化Fig.1 Change of solid color

圖2 姜黃素、鄰苯二酚及其共晶的DSC圖Fig.2 DSC spectra of curcumin,catechol and their cocrystal

在姜黃素與鄰苯二酚等摩爾比研磨的過程中，固體外觀顏色從原來姜黃素的黃色粉末變成了橘紅色粉末，如圖1所示。

2.2 差示掃描量熱法分析

姜黃素、鄰苯二酚及其共晶的差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，姜黃素在186.5 ℃處出現(xiàn)一個(gè)熔融吸熱峰，同其熔點(diǎn)(183 ℃)接近，吸熱峰為1.069 mW/mg；鄰苯二酚在108.6 ℃ 處出現(xiàn)一個(gè)熔融吸熱峰，同其熔點(diǎn)(105 ℃)接近，吸熱峰為1.787 mW/mg；姜黃素-鄰苯二酚共晶在150.3 ℃處出現(xiàn)一個(gè)熔融吸熱峰，吸熱峰為0.351 4 mW/mg，推測為其熔點(diǎn)。共晶熔點(diǎn)的改變是由于API和CCF之間形成氫鍵后，改變了原材料分子晶體排列，從而形成了新晶相的緣故。通常，共晶的熔點(diǎn)介于API和CCF之間[17]。姜黃素-鄰苯二酚共晶符合這一特點(diǎn)，這可以作為判定新物相屬于共晶的一個(gè)依據(jù)。

2.3 X射線粉末衍射分析

姜黃素、鄰苯二酚及其共晶的X射線衍射分析(phase analysis of X-ray diffraction, PXRD)結(jié)果見圖3。由圖3可知，姜黃素-鄰苯二酚共晶在11.159°、13.559°、20.800°和21.519°出現(xiàn)了新的特征峰，原本歸屬于姜黃素的15.161°、16.398°和18.180°以及鄰苯二酚的16.199°、20.040°、23.059°、38.357°和40.720°的特征峰消失。圖譜顯示，姜黃素-鄰苯二酚共晶的粉末衍射并不是2種組成物姜黃素和鄰苯二酚的簡單疊加，而是具有明確的特征峰，符合形成共晶的特征。

圖3 姜黃素、鄰苯二酚及其共晶的PXRD圖Fig.3 PXRD pattern of curcumin,catechol and their cocrystal

2.4 傅里葉紅外光譜分析

紅外光譜采用溴化鉀壓片法，收集 4 000～400 cm-1數(shù)據(jù)。圖4為姜黃素、鄰苯二酚及其共晶的傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR )圖。由圖4可知，姜黃素和鄰苯二酚的酚羥基—OH伸縮振動分別位于3 508 cm-1和3 449 cm-1，這兩個(gè)吸收峰在姜黃素-鄰苯二酚共晶中明顯轉(zhuǎn)移到了3 406 cm-1較低波數(shù)，且振動峰變寬。這是因?yàn)榻S素-鄰苯二酚共晶之間存在O—H—O氫鍵，形成氫鍵之后，化合物本身的特征峰并不會消失，只是由于形成了氫鍵，各個(gè)共價(jià)鍵的鍵長和鍵能會有略微改變，在紅外圖譜上表現(xiàn)為特征峰的位移。形成氫鍵之后給體上的O—H鍵受到較大的影響，O—H的鍵能降低，鍵的長度會增加，O—H紅外振動的特征峰會發(fā)生較大的紅移，紅外光譜上的紅移程度與所形成氫鍵的強(qiáng)度有關(guān)，形成氫鍵的強(qiáng)度越強(qiáng)，發(fā)生紅移的位移就越大。除了酚羥基之外，還觀察到其他官能團(tuán)的光譜偏移，包括C=O、C—O和C=C[18]。

圖4 姜黃素、鄰苯二酚及其共晶的FTIR圖 Fig.4 FTIR spectra of curcumin,catechol and their cocrystal

2.5 共晶制備溶劑篩選

為了得到規(guī)整的姜黃素-鄰苯二酚共晶，篩選了25種不同的溶劑，溶解結(jié)果如表1所示。

表1 共晶溶劑篩選及結(jié)果Table 1 Screening results of cocrystal solvent

表1 (續(xù))

在25種有機(jī)溶劑中，姜黃素-鄰苯二酚共晶除了不溶于二氯甲烷+石油醚(1∶1)外，在其余溶劑中均能溶解：在乙醇溶劑中出現(xiàn)絮狀沉淀；在甲醇+苯(1∶1)、甲醇+苯(1∶2)和甲醇+甲苯(1∶1)溶劑中出現(xiàn)了橘紅色粉末；在丙酮+苯(1∶1)和丙酮+甲苯(1∶1)溶劑中出現(xiàn)了黃色粉末；在丙酮+水(1∶1)和丙酮+二氯甲烷(1∶1)溶劑中別分析出了黃色片狀和橘紅色片狀物質(zhì)；在乙腈+二氯甲烷(1∶1)和乙腈+二氯甲烷(1∶2)溶劑中出現(xiàn)了橘紅色團(tuán)聚；其余溶劑中均無固體析出。當(dāng)以甲醇為溶劑時(shí)，可得到柱狀規(guī)整的共晶。

2.6 掃描電子顯微鏡分析

圖5 共晶掃描電鏡圖Fig.5 SEM of cocrystal

將姜黃素-鄰苯二酚共晶粉末與甲醇溶劑中析出的共晶進(jìn)行掃描電子顯微鏡分析，結(jié)果如圖5所示。從掃描電鏡中可以看出兩者共晶的形態(tài)明顯不同。姜黃素-鄰苯二酚共晶粉末在5 000倍的放大倍數(shù)下，表面形態(tài)特性為不規(guī)則顆粒的聚集；在甲醇溶劑中重結(jié)晶得到的姜黃素-鄰苯二酚共晶在65倍的放大倍數(shù)下，表面形態(tài)為光滑的柱狀晶體。

3 結(jié) 論

本研究采用姜黃素作為藥物活性成分，鄰苯二酚作為共晶形成物，通過研磨法得到姜黃素-鄰苯二酚新型藥物共晶。在制備共晶的過程中沒有加入其他溶劑，減少了非共晶組分對結(jié)晶過程的影響，減少了溶劑的負(fù)效應(yīng)。DSC測定發(fā)現(xiàn)共晶只有1個(gè)熔點(diǎn)(150.3 ℃)，且介于API和CCF之間；PXRD測定發(fā)現(xiàn)共晶并不是2種組合物的簡單疊加，在11.159°、13.559°、20.800°和21.519°有新的衍射角出現(xiàn)；對FTIR進(jìn)一步分析，共晶中的酚羥基由于形成了氫鍵，紅外振動的特征峰發(fā)生了較大的紅移。采用室溫溶劑揮發(fā)法，在甲醇溶劑中重結(jié)晶得到姜黃素-鄰苯二酚橘紅色柱狀共晶，并在掃描電子顯微鏡下觀察到表面形態(tài)與共晶粉末有較大的差別，但姜黃素-鄰苯二酚共晶是否能改善姜黃素的水溶性還有待研究。

[1] SALEM M, ROHANI S, GILLIES E R. Curcumin, a promising anti-cancer therapeutic: a review of its chemical properties, bioactivity and approaches to cancer cell delivery[J]. RSC Advances,2014,4:10815.

[2] HATCHER H, PLANALP R, CHO J, et al. Curcumin: from ancient medicine to current clinical trials[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2008,65(11):1631.

[3] SANPHUI P, GOUD N R, KHANDAVILLI U B R, et al. Fast dissolving curcumin cocrystals[J]. Crystal Growth and Design,2011,11(9):4136.

[4] ANAND P, KUNNUMAKKARA A B, NEWMAN R A, et al. Bioavailability of curcumin:problems and promises[J]. Molecular Pharmaceutics,2007,4(6):814.

[5] ANTONY B, MERINA B, IYER V S, et al. A pilot cross-over study to evaluate human oral bioavailability of BCM-95CG (Biocurcumax), a novel bioenhanced preparation of curcumin[J]. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences,2008,70(4):445.

[6] 王彪, 殷志楊. 姜黃素劑型研究進(jìn)展[J]. 首都醫(yī)藥,2012(6):55.

[7] LARAOCHOA F, ESPINOSAPEREZ G. Cocrystals definitions[J]. Supramolecular Chemistry,2007,19(8):553.

[8] GADADE D D, PEKAMWAR S S. Pharmaceutical cocrystals: regulatory and strategic aspects, design and development[J]. Advanced Pharmaceutical Bulletin,2016,6(4):479.

[9] KUMINEK G, CAO F, ROCHA A, et al. Cocrystals to facilitate delivery of poorly soluble compounds beyond-rule-of-5[J]. Advanced Drug Delivery Reviews,2016,101:143.

[10] ZHOU Z, LI W, SUN W J, et al. Resveratrol cocrystals with enhanced solubility and tabletability[J]. International Journal of Pharmaceutics,2016,509(1/2):394.

[11] 徐輝, 張方坤, 遲宗良,等. 姜黃素賴氨酸共晶的制備及不同晶型溶解性對比[J]. 中國藥師,2017,20(2):209.

[12] CHOW S F, SHI L, NG W W, et al. Kinetic entrapment of a hidden curcumin cocrystal with phloroglucinol[J]. Crystal Growth and Design,2014,14(10):5080.

[13] TRASK A V, MOTHERWELL W D S, JONES W. Solvent-drop grinding: green polymorph control of cocrystallisation[J]. Chemical Communications,2004,10(7):890.

[14] GOUD N R, SURESH K, SANPHUI P, et al. Fast dissolving eutectic compositions of curcumin[J]. International Journal of Pharmaceutics,2012,439(1/2):63.

[15] KARKI S, FRISCIC T, JONES W, et al. Screening for pharmaceutical cocrystal hydrates via neat and liquid-assisted grinding[J]. Molecular Pharmaceutics,2007,4(3):347.

[16] SANPHUI P, GOUD N R, KHANDAVILLI U B R, et al. Fast dissolving curcumin cocrystals[J]. Crystal Growth and Design,2011,11(9):4135.

[17] 王義成,馮成亮,楊素勤,等. 藥物共晶的最新研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)進(jìn)展,2013,37(3):120.

[18] 策登道日吉,洪海龍,尤麗娟,等. 姜黃素的分離純化及其形貌可控超細(xì)微粒的制備[J]. 中國食品添加劑,2014(3):149.