何濤+趙娜

摘要：采用腹背聯(lián)合按摩法采集雞精液，預處理后添加含有不同濃度的紅景天多糖、枸杞多糖和海帶多糖冷凍稀釋液進行稀釋，檢測冷凍解凍后雞精子的活率、質(zhì)膜完整率、線粒體活性、頂體完整率。結(jié)果表明紅景天多糖、枸杞多糖、海帶多糖最佳添加量分別為1.00、0.75、0.50 mg/mL，精子凍后活率穩(wěn)定在40%以上。

關(guān)鍵詞：雞精液；紅景天多糖；枸杞多糖；海帶多糖；種蛋孵化率

中圖分類號：S814.3；S831 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2018）01-0005-02

隨著人們對禽類食品需求量的日益增加，中國養(yǎng)禽業(yè)規(guī)?；c集約化程度逐年提高，人工授精技術(shù)在養(yǎng)禽業(yè)得到了快速發(fā)展?；\養(yǎng)雞的人工輸精大多采用原精，但原精輸精存在一定的缺陷，公雞射精量少、精子密度大、在高溫條件下體外存活時間短，在公雞使用的早期和晚期易出現(xiàn)精液缺乏現(xiàn)象，雞精液稀釋技術(shù)可有效解決這類問題[1]。好的稀釋液不僅可以提供精子生存活動的良好環(huán)境，并且將其稀釋可以使密度高、容量低的雞精液分布均勻，能夠擴大其精液量，增強其授精能力[2]。本試驗主要確定紅景天多糖、海帶多糖、枸杞多糖在雞精液稀釋液中的最佳作用濃度，以提高雞人工輸精后的種蛋孵化率和健雛率。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司的冠大而鮮紅、性反射功能好、精液品質(zhì)符合要求的20只50周齡公雞，根據(jù)日常輸精劃分為兩組，兩組公雞輪換使用，采精2 d，休息1 d。

1.2 試驗儀器與試劑

進口液氮罐（TAYLOR-WHARTON）；超純水制備器（PureLabTMPlus，Pall公司，德國）；生物冷凍儀（BIOTRONICS LIMIED，英國）；倒置熒光顯微鏡（NIKON120型，日本）；全自動高速離心機（Heraeus，德國）；高壓消毒柜（Thermo電子公司，美國）；保溫水壺、冰箱、水浴鍋等。

D-葡萄糖（0188-500 g）、D-果糖（F2793-500 mg）、二水檸檬酸三鈉（S4641-500 g）、檸檬酸（北京世紀星化工有限責任公司）、碳酸氫鈉、Tris、EDTA、甘油、氯化鈉、氯化鉀、青霉素G鉀（P-7794）、硫酸鏈霉素（0382-25 g）、甘油（0854-100 mL）、卵黃、碘化丙啶、羅丹明123、FITC-PNA、雙蒸水等。

紅景天多糖標準品、枸杞多糖標準品、海帶多糖標準品購自上海源葉生物公司。

冷凍基礎液TCG：葡萄糖1.1 g，檸檬酸1.48 g，Tris 2.42 g，青霉素鈉0.06 g，硫酸鏈霉素0.1 g，加雙蒸水至100 mL，調(diào)節(jié)pH至6.21，滲透壓286 mOsm/L。

精子低滲液：二水檸檬酸鈉0.735 g，果糖1.351 g，加雙蒸水至100 mL。

冷凍保存I液：冷凍基礎液加20%（V/V）的卵黃。

冷凍保存II液：冷凍保存I液添加不同體積比的甘油。

1.3 精液處理

將合格的精液保存在保溫壺（32～35 ℃）中，帶回實驗室后分裝，按照所采精液密度的大小每個離心管分裝5～10 mL，加等量的BTS液，紗布包裹，15 ℃下平衡3 h。800 g離心10 min，取出，棄上清。加入I液（80%TCG+20%卵黃），按1∶2稀釋。在4 ℃下平衡3 h后，添加甘油使其最終濃度為3%，最終稀釋倍數(shù)為1∶3。在4 ℃下平衡1～2 h。用細管分裝，封口。然后放入程序冷凍儀中以1 ℃/min從5 ℃降到-5 ℃，迅速取出放置于自制冷凍盒中，在距液氮面3 cm處熏蒸3 min。將超低溫溫度計探針與冷凍槽連接，當溫度降到-120 ℃時迅速投入液氮保存。解凍，放置37 ℃培養(yǎng)箱中待測。

1.4 統(tǒng)計分析

應用SPSS18.0軟件進行顯著性檢驗，數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 試驗設計

在試驗中分別添加濃度梯度為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL紅景天多糖、海帶多糖、枸杞多糖，同時以TCG作為的對照，比較解凍后精子的活率、質(zhì)膜完整率、線粒體活性、頂體完整率。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度紅景天多糖對公雞精子冷凍解凍效果的影響

不同濃度紅景天多糖對公雞精子冷凍解凍效果的影響見表1。由表1可見，添加不同濃度梯度的紅景天多糖均可提高公雞精子凍后活率、質(zhì)膜完整率，頂體完整率、線粒體活性等質(zhì)量參數(shù)。其中以添加1.00 mg/mL的效果最好。

3.2 不同濃度枸杞多糖對公雞精子冷凍解凍效果的影響

不同濃度枸杞多糖對公雞精子冷凍解凍效果的影響見表2。由表2可見，添加不同濃度梯度的枸杞多糖均可提高公雞精子凍后活率、質(zhì)膜完整率，頂體完整率、線粒體活性等質(zhì)量參數(shù)。其中以添加0.75 mg/mL的精子活率最高。

3.3 不同濃度海帶多糖對公雞精子冷凍解凍效果的影響

不同濃度海帶多糖對公雞精子冷凍解凍效果的影響見表3。由表3可見，添加不同濃度梯度的海帶多糖均可提高公雞精子凍后活率、質(zhì)膜完整率，頂體完整率、線粒體活性等質(zhì)量參數(shù)。其中以添加0.50 mg/mL的精子活率最高。

4 小結(jié)與討論

紅景天多糖主要用于免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、降血脂、和血糖、抗輻射、抗氧化、抗突變、耐缺氧及抗疲勞等[3]。枸杞多糖（LBP）是由阿拉伯糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，半乳糖和葡萄糖中性單糖和半乳糖醛酸及18種氨基酸等組成，作為傳統(tǒng)的中草藥提取物，具有抗衰老、抗氧化、抗細胞凋亡，調(diào)節(jié)血糖等多種生物活性[4]。海帶多糖作為傳統(tǒng)的中草藥提取物，具有抗衰老、抗氧化、抗細胞凋亡，調(diào)節(jié)血糖等多種生物活性[5]。其原理是通過促進細胞脫水和在胞膜外形成保護膜來保持細胞的活性[6]。本試驗結(jié)果表明，按不同濃度梯度在稀釋液中添加0.25～1.25 mg/mL的紅景天多糖、枸杞多糖和海帶多糖可提高公雞精子凍后活率、質(zhì)膜完整率，頂體完整率、線粒體活性等質(zhì)量參數(shù)。

本試驗將3種多糖應用到公雞精子冷凍方面，試驗結(jié)果令人驚喜，其對公雞精子冷凍保存的保護作用可能源于多糖所具有的較強抗氧化性、抗衰老和防止細胞凋亡等特性，也可能是由于抑制了活性氧的產(chǎn)生，提高了過氧化物酶的活性，使細胞質(zhì)膜免受脂質(zhì)過氧化損傷，防止了細胞內(nèi)酶類的外流[7]。但是多糖的構(gòu)成成分復雜，結(jié)構(gòu)多變，造成溶液的滲透壓偏高，公雞精子對滲透壓較為敏感，所以應嚴格把握3種多糖的添加量。

多糖用途廣泛，主要用于免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、降血脂和血糖、抗輻射、抗氧化、抗突變、耐缺氧及抗疲勞等。紅景天多糖、枸杞多糖、海藻多糖在很多領(lǐng)域都有相關(guān)的研究和探討。本試驗將其應用到公雞精子冷凍方面，在公雞的精液冷凍過程中，在傳統(tǒng)的稀釋液TCG基礎上，添加紅景天多糖、枸杞多糖、海帶多糖均可以提高精子凍后活率、頂體完整性、線粒體活性和質(zhì)膜完整率，與對照組比較差異顯著（P<0.05），結(jié)果證實紅景天多糖、枸杞多糖、海帶多糖最佳添加量分別為1.00、0.75、0.50 mg/mL。 其中以1.00 mg/mL紅景天多糖冷凍保護效果較好。

參考文獻：

[1] 戴有理譯.家禽精液稀釋液的發(fā)展[J].中國家禽，1992，14（6）：34-36.

[2] 韓雪峰，劉福注，楊長鎖.公雞精液稀釋液的研究進展[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2003（6）：40-43.

[3] 鄧勝國，尹愛武，田 潤，等.大花紅景天多糖的抗衰老作用[J].中國老年學，2014，34（8）：2161-2162.

[4] 方建國，丁水平，田庚元.枸杞多糖藥理作用與臨床應用[J].醫(yī)藥導報，2004，23（7）：484-485.

[5] 詹林盛，張新生，吳曉紅，等.海帶多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國生化藥物雜志，2001，22（3）：116-118.

[6] 南向斌.三種多糖和冷凍平衡時間對牛精液冷凍效果影響的研究[J].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2010.

[7] 張曉華，孫 鏖，易康樂，等.雞精液稀釋液配制及效果分析[J].中國家禽，2015，37（21）：71-73.endprint