★ 宋文龍 陳章生 陳豫生 龔莉 蘭智慧**

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)碩士研究生 南昌 330004；3.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院 南昌 330003)

慢性阻塞性肺疾病( COPD) 不僅是一種氣道和肺部的疾病，也是由多種危險(xiǎn)因素共同參與、多種生物機(jī)制同時(shí)介導(dǎo)的全身多系統(tǒng)性慢性炎癥反應(yīng)性疾病C0PD病變主要損害患者肺部，患者臨床主要表現(xiàn)為慢性的咳嗽，以清晨明顯，有少許黏液性痰及呼吸困難等，同時(shí)也會(huì)引起患者產(chǎn)生全身效應(yīng)，其中合并營(yíng)養(yǎng)不良較為常見(jiàn)[1]。近年來(lái)，有研究表明腫瘤壞死因子、血清前白蛋白與COPD發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切[2-9]。COPD屬中醫(yī)學(xué)“咳嗽”“肺脹”“喘證”等范疇，國(guó)醫(yī)大師洪廣祥教授認(rèn)為其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，其中宗氣虛弱為本，痰瘀實(shí)邪為標(biāo)，在臨床應(yīng)用補(bǔ)益宗氣方積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)研究擬通過(guò)觀察補(bǔ)益宗氣方對(duì)COPD大鼠氣道結(jié)構(gòu)，體重、血清前白蛋白(Prealbumin)及腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響，探討補(bǔ)益宗氣方改善COPD大鼠營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康純系雄性SD大鼠30只(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào):NO.43004700009069)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 中藥飲片由附屬醫(yī)院小包裝藥房提供；補(bǔ)益宗氣方組成及劑量：西黨參30g、生黃芪30g、炒白術(shù)15g、當(dāng)歸10g、升麻10g、北柴胡10g、鎖陽(yáng)15g、山萸肉15g、陳皮10g、炙甘草10g。

上述飲片拆封后按趙瑞華[10]文獻(xiàn)內(nèi)所述方法，用冷水浸泡0.5h后用煎藥砂鍋進(jìn)行煎煮，共兩遍，后將所得水劑密封后低溫保存，按需取用。灌胃前室溫下放置1h。

1.2.2 主要試劑 血清前白蛋白及TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒：湖北武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司提供，規(guī)格及批號(hào)：96TL141212626、96T L141122631。脂多糖(LPS)固體 每支含10mg，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，貨號(hào)：Sigma-L2880。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 每10只大鼠為一個(gè)單元飼養(yǎng)，隨機(jī)分為空白組、模型組、觀察組。采用氣管內(nèi)注射脂多糖溶液加香煙煙霧煙熏及冷風(fēng)刺激方法[11]：COPD模型組及觀察組第1、14d在氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)溶液后，2～13d及15～28d則持續(xù)熏煙30min，香煙量約20支/d，香煙煙霧熏煙后，立刻移至室外冷風(fēng)刺激1h(室內(nèi)外溫差約5℃)。29～42d，觀察組則給予補(bǔ)益宗氣湯灌胃進(jìn)行干預(yù)，第43d，將各組大鼠稱重，在乙醚麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈抽血[12]致死,并立即取右肺下葉組織，經(jīng)10%甲醛固定。

1.4 肺組織病理切片的制備 取出固定好的肺組織，常規(guī)石蠟包埋，4μm 切片。切片用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗；蘇木素染色后自來(lái)水沖洗；鹽酸乙醇分化；自來(lái)水浸泡15 min；置伊紅液2 min；常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腫瘤壞死因子及血清前白蛋白水平 使用離心機(jī)提取血清并用相關(guān)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)盒測(cè)定腫瘤壞死因子、血清前白蛋白水平。將酶標(biāo)板除第1孔(對(duì)照孔)外的空白微孔按順序，分別加入100μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入100μL的血清；將100μL pH為7.0～7.2的PBS 液加入到空白對(duì)照孔。將50μL的酶標(biāo)記溶液加入到除對(duì)照孔外各孔中后。 將微孔板輕輕搖動(dòng)后密封，放置37℃孵育箱中，1h后，將微孔板取出,去掉反應(yīng)物，使用洗滌液清洗酶標(biāo)板，將顯色劑A 50μL、B 50μL次序加入各孔中后，在37℃下，避光反應(yīng)，15min后，將終止液50μL，加入各孔中。最后使用450nm光，測(cè)定各孔的吸光度OD值后，輸入橫、縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為標(biāo)注品的6個(gè)濃度值，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，畫(huà)出曲線，應(yīng)用軟件分析得出計(jì)算的公式，將血清樣本所測(cè)得的OD值，使用分析得出公式算出各血清樣本中各相關(guān)指標(biāo)濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的表現(xiàn) 在造模期間，觀察組和模型組大鼠均出現(xiàn)煩躁不安，并且先后出現(xiàn)咳嗽、氣促、少動(dòng)，遲緩，蜷縮一團(tuán)、精神萎靡，飲食減少、毛發(fā)枯槁，體重增長(zhǎng)緩慢，個(gè)別大鼠體重減輕，從造模開(kāi)始后第6d起有大鼠出現(xiàn)噴嚏、流涕，此后陸續(xù)有大鼠出現(xiàn)噴嚏及呼吸加快癥狀，模型組有一部分大鼠持續(xù)至第43d，觀察組通過(guò)服用中藥癥狀逐漸減輕，至第43d處死時(shí)基本恢復(fù)；空白組表現(xiàn)正常。

2.2 對(duì)模型組大鼠肺組織病理的初步觀察 對(duì)大鼠進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺體積明顯增大，外觀蒼白、粗糙不平。固定切片后在光鏡下可以觀察到支氣管纖毛柱狀上皮增厚，氣管黏膜下腺體增生肥大，杯狀細(xì)胞增生明顯，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下及外膜膠原纖維增生，支氣管平滑肌明顯增厚，終末細(xì)支氣管炎癥浸潤(rùn)明顯，同時(shí)肺泡、肺泡囊擴(kuò)大以及排列結(jié)構(gòu)紊亂。

2.3 光鏡下對(duì)大鼠肺組織切片的病理形態(tài)觀察 在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察三組大鼠的支氣管肺組織病理改變，以下分別為HE染色圖片、馬松染色圖片(見(jiàn)圖1、圖2)。

空白組上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，小氣道及肺泡未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組上皮細(xì)胞壞死，脫落，可見(jiàn)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，小氣道可見(jiàn)彈力纖維、膠原纖維，肺泡壁變薄，甚至斷裂；觀察組上皮細(xì)胞壞死較模型組減輕，炎性浸潤(rùn)亦減輕，仍可見(jiàn)少許彈力纖維。

空白組小氣道周?chē)鷥H少量藍(lán)色膠原纖維沉積；模型組小氣道周?chē)罅克{(lán)色膠原纖維沉積，氣道壁增厚；觀察組小氣道周?chē){(lán)色膠原纖維較模型組減少。

圖1 三組大鼠支氣管肺組織HE染色所顯示的病理改變(×200)

圖2 三組大鼠支氣管肺組織Masson染色顯示的病理改變(×400)

光鏡下觀察肺組織切片發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織細(xì)支氣管纖毛上皮結(jié)構(gòu)不完整，部分缺失，杯狀上皮細(xì)胞增生明顯，氣管粘膜下層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(主要為淋巴細(xì)胞)，觀察組氣道及肺組織炎癥浸潤(rùn)程度較模型組輕，而空白組肺組織中未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示COPD大鼠模型建立成功。

2.4 大鼠的體重 造模前三組大鼠體重?zé)o明顯差異，造模后模型組及觀察組大鼠間體重增長(zhǎng)無(wú)明顯差異，但顯著低于空白組，而以補(bǔ)益宗氣方對(duì)觀察組進(jìn)行干預(yù)后，該組大鼠體重增長(zhǎng)值顯著高于模型組，低于空白對(duì)照組。各組大鼠體重增長(zhǎng)，情況見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠體重

注：與空白組比較，*P<0. 05；與模型組比較，#P<0. 05；與治療前比較，△P<0. 05 。

2.5 血清前白蛋白的比較 造模后模型組及觀察組大鼠血清前白蛋白水平顯著低于空白組，模型組及觀察組間血清前白蛋白水平差異則無(wú)顯著性，而以補(bǔ)益宗氣方對(duì)觀察組進(jìn)行干預(yù)后，其血清前白蛋白水平顯著高于模型組，仍低于空白組，具體見(jiàn)表2。

組別治療前前白蛋白(ug/mL)治療后前白蛋白(ug/mL)空白組234．82±7．87237．7±6．58模型組 98．94±5．41? 101．60±4．27?觀察組 99．05±5．68? 182．78±7．34?#△

注：與空白組比較，*P<0. 05；與模型組比較，#P<0. 05；與治療前比較，△P<0. 05。

2.6 血清腫瘤壞死因子的比較 造模后模型組及觀察組大鼠血清TNF-α水平顯著高于空白組，模型組及觀察組間血清TNF-α水平差異則無(wú)顯著性，以補(bǔ)益宗氣方對(duì)觀察組進(jìn)行干預(yù)后，其血清TNF-α水平顯著低于治療前，治療后的模型組大鼠，仍高于空白組，具體見(jiàn)表3。

組別治療前TNF-α(ng/L)治療后TNF-α(ng/L)空白組131．05±6．59133．17±5．69模型組 199．41±70．32? 208．73±91．0?觀察組 181．05±6．59? 150．92±14．35?#△

注：與空白組比較，*P<0. 05；與模型組比較，#P<0. 05；與治療前比較，△P<0. 05。

3 討論

COPD屬中醫(yī)學(xué)“喘證”“咳嗽”“肺脹”范疇，主要表現(xiàn)為長(zhǎng)期反復(fù)的咳嗽、咳痰，逐漸出現(xiàn)喘促、胸膺膨滿、憋悶如塞，重者可有唇甲青紫，心悸，肢腫等癥，發(fā)展成肺心病。目前，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜是慢性阻塞性肺疾病證候的基本特點(diǎn)。國(guó)醫(yī)大師洪廣祥教授根據(jù)臨床上COPD合并營(yíng)養(yǎng)不良患者存在咳嗽喘促，少氣不足以息，語(yǔ)言低微，身倦乏力等特征，認(rèn)為慢阻肺病人普遍存在營(yíng)養(yǎng)障礙的情況，是緣于宗氣虛衰，元?dú)獠荒艿玫匠漯B(yǎng)，肺脾氣弱，不能正常運(yùn)化水谷精微，輸布障礙，供給不足，臟腑及肌膚失養(yǎng)，故肺氣脹滿，又呼吸過(guò)度，耗氣傷津過(guò)甚，形體逐漸消瘦，日趨羸弱[13]。《靈樞》曰:“大氣入于臟腑者,不病而卒死矣”。說(shuō)明了宗氣虛衰，導(dǎo)致患者死亡的病理過(guò)程。

目前對(duì)肺脹的治療，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為急則治其標(biāo)，緩則治其本。洪教授則指出慢阻肺在急性發(fā)作期與穩(wěn)定期均可出現(xiàn)虛中夾實(shí)，提出宗氣虛弱是慢性阻塞性肺疾病發(fā)生發(fā)展的重要內(nèi)因，在疾病全程皆可治以補(bǔ)益宗氣[14-18]。

COPD 患者最顯著的特征就是體質(zhì)量下降、血液營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)下降及免疫力下降加重感染。目前認(rèn)為機(jī)體的過(guò)度能量消耗、高代謝以及患者本身攝入不足是COPD 合并營(yíng)養(yǎng)不良的主要原因，有研究表明腫瘤壞死因子等炎癥因子引起的代謝紊亂可能是患者營(yíng)養(yǎng)狀況下降的重要原因[19]。本實(shí)驗(yàn)以上述幾種指標(biāo)為切入點(diǎn)，通過(guò)觀察COPD模型大鼠肺部組織形態(tài)的變化以及對(duì)血清前白蛋白、腫瘤壞死因子的定量檢測(cè)，觀察補(bǔ)益宗氣湯對(duì)COPD模型大鼠體內(nèi)血清前白蛋白、腫瘤壞死因子含量水平及體重的影響。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，證明補(bǔ)益宗氣湯可以有效的降低腫瘤壞死因子含量，增加血清前白蛋白含量，以達(dá)到改善COPD大鼠營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的作用。

3.1 體重變化 在試驗(yàn)中，造模前三組大鼠間體重?zé)o明顯差異。造模后模型組、大鼠體重較空白組增長(zhǎng)更慢，體重較空白組輕。經(jīng)補(bǔ)益宗氣方干預(yù)后觀察組高于治療前及治療后的模型組，仍低于空白組，由此，我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)補(bǔ)益宗氣方可促進(jìn)大鼠攝食，有效增加COPD大鼠體重,從而改善COPD大鼠營(yíng)養(yǎng)狀況。

3.2 血清前白蛋白 血清前白蛋白(prealbumin，PA)是存在于血漿中的一種急性相反應(yīng)蛋白，主要存在于血液和腦脊液中，其水平與蛋白質(zhì)的代謝有關(guān)，可靈敏反映機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)及肝臟合成功能，與機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

造模后，模型組大鼠前白蛋白含量較空白組顯著降低；觀察組治療后大鼠血清前白蛋白較治療前顯著升高，較模型組治療后升高明顯。說(shuō)明通過(guò)補(bǔ)益宗氣方，可提升COPD大鼠血清前白蛋白水平，營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)得到相應(yīng)改善。

3.3 腫瘤壞死因子 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，能誘導(dǎo)腫瘤組織出血壞死的物質(zhì)，除抗腫瘤作用外，還參與炎癥、發(fā)熱以及機(jī)體脂肪、蛋白質(zhì)的分解代謝等病理生理過(guò)程[20]。通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝入，降低脂生成關(guān)鍵酶如乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶的表達(dá)，促進(jìn)脂肪分解，抑制脂肪細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞及前脂肪細(xì)胞凋亡，參與了眾多慢性消耗性疾病惡病質(zhì)的發(fā)生。Schols等[21]研究認(rèn)為T(mén)NF-α與COPD的高代謝有關(guān)，TNF-α可能通過(guò)增加能量消耗導(dǎo)致COPD患者的營(yíng)養(yǎng)不良。本研究結(jié)果也證實(shí)該觀點(diǎn)，且大鼠血清TNF-α水平與前白蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，提示TNF-α生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮對(duì)血清前白蛋白有影響。

本研究結(jié)果顯示，造模后，COPD模型及觀察組大鼠血清TNF-α濃度明顯高于對(duì)照組，且血清TNF-α濃度與體質(zhì)量呈顯著負(fù)相關(guān)；觀察組治療后大鼠血清TNF-α較治療前顯著降低，較模型組治療后降低。結(jié)合治療前后各組大鼠血清前白蛋白水平的變化，提示TNF-α參與了COPD營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)生，證實(shí)通過(guò)補(bǔ)益宗氣方，可降低COPD大鼠血清TNF-α水平， 抑制炎癥反應(yīng)，改善COPD大鼠營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。其中，模型組中有個(gè)別大鼠治療前后TNF-α水平遠(yuǎn)高于該組平均值，考慮可能為造模刺激后誘發(fā)腫瘤導(dǎo)致。

綜上所述，營(yíng)養(yǎng)不良是COPD 的常見(jiàn)肺外表現(xiàn)，也是COPD 預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可加重COPD 疾病的進(jìn)展，本研究提示：補(bǔ)益宗氣方能改善COPD營(yíng)養(yǎng)不良大鼠的營(yíng)養(yǎng)狀況，其作用機(jī)制在于能降低大鼠血清腫瘤壞死因子水平，提高血清前白蛋白水平。結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外對(duì)COPD合并營(yíng)養(yǎng)不良傾向于在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上配合營(yíng)養(yǎng)支持及適當(dāng)鍛煉的觀點(diǎn)，我們認(rèn)為，在臨床治療中，對(duì)COPD 患者進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)篩查及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)，制訂不同的長(zhǎng)期分級(jí)營(yíng)養(yǎng)支持治療方案，合理、均衡地搭配腸內(nèi)和(或)腸外營(yíng)養(yǎng)，并輔以具有代謝支持作用的物質(zhì)，結(jié)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，配合辨證服用補(bǔ)益宗氣湯，可改善臨床預(yù)后。我們將在下一步工作中繼續(xù)深入研究，為補(bǔ)益宗氣方的臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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