孫啟星，侯杰，周其洋，童星*

(1.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528500)

釀造調(diào)味品含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，容易引起微生物的生長(zhǎng)繁殖，使食品發(fā)生變質(zhì)。在食品生產(chǎn)過程中，通常添加食品防腐劑殺菌或抑菌來保持食品品質(zhì)。目前在調(diào)味品行業(yè)中，常用的防腐劑主要為化學(xué)防腐劑，如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等。隨著人們生活水平的日益提高，越來越多的消費(fèi)者追求綠色食品，并且更加強(qiáng)調(diào)天然防腐劑的使用，因而探索天然產(chǎn)物作為食品防腐劑已成為研究熱點(diǎn)[1]。天然防腐劑是指從天然生物中提取的具有抑制微生物生長(zhǎng)和保護(hù)產(chǎn)品的功能性物質(zhì)，根據(jù)其來源不同，分為微生物源防腐劑、植物源防腐劑和動(dòng)物源防腐劑，其具有化學(xué)合成防腐劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如：抗菌性強(qiáng)、安全性高、熱穩(wěn)定性好、作用范圍廣等[2]。微生物源防腐 劑是指微生物本身或其代謝產(chǎn)物具有抑菌防腐的功效，是一種安全無毒、天然高效的食品防腐劑，可通過微生物培養(yǎng)過程進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[3]。本文主要介紹了3種常見的微生物源食品防腐劑的理化性質(zhì)、抑菌機(jī)制、抑菌性以及在調(diào)味品中的應(yīng)用研究，旨在為開發(fā)高效、安全的天然防腐劑應(yīng)用于調(diào)味品行業(yè)的研究提供參考。

1 乳酸鏈球菌素

1.1 理化性質(zhì)

乳酸鏈球菌素(Nisin)是由34個(gè)氨基酸組成組成的多肽抗菌素類物質(zhì)，分子量為3150 Da，其活性體為二聚體或四聚體[4]。Nisin作為一種白色易流動(dòng)的粉末，其穩(wěn)定性和溶解性都與溶液pH值密切相關(guān)，在中性和堿性條件下幾乎不溶解，食品加工應(yīng)用時(shí)要先用酸性溶液溶解。在pH 6.5條件下，85 ℃加熱15 min，活性損失40%，而在pH 2.0鹽酸中，121 ℃高溫滅菌仍保持活性。Nisin對(duì)人體無毒害作用，易被消化水解為氨基酸，并且不改變腸道內(nèi)正常菌落，是一種安全的防腐劑。

1.2 抑菌機(jī)制

Nisin的抑菌機(jī)理還沒有明確的定論，目前已研究成果表明，Nisin是帶正電荷、疏水性的多肽物質(zhì)，能結(jié)合于細(xì)胞壁上帶負(fù)電荷的磷壁酸、酸性多糖或磷脂分子上，抑制細(xì)胞壁主要成分合成或與細(xì)胞膜形成孔道復(fù)合物，消耗ATP，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而終止細(xì)胞的一系列能源反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)ATP、離子等流出，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外能差消失，引起細(xì)胞死亡或消融[5]。Breukink E等[6]研究表明Nisin主要依賴于肽聚糖分子作用在細(xì)胞膜上，形成空洞，造成內(nèi)容物的泄露，導(dǎo)致細(xì)胞自溶死亡。Zhao Xingchen等[7]通過基因表達(dá)方式分析，Nisin是通過阻礙金黃色葡萄球菌中主要功能性基團(tuán)的轉(zhuǎn)錄而起到抑菌作用，對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行了微觀研究。Nisin對(duì)芽孢的作用是在芽孢萌發(fā)前期破壞膜結(jié)構(gòu)，抑制其發(fā)芽而非殺死芽孢。

1.3 抑菌特性

乳酸鏈球菌素能有效地殺死或抑制食品腐敗變質(zhì)的革蘭氏陽性菌，如產(chǎn)芽孢桿菌、耐熱腐敗菌、葡萄球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，根據(jù)這一特性它被廣泛地應(yīng)用在經(jīng)熱處理的包裝食品中作為防腐劑。Nisin對(duì)革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌沒有抑制作用，但是與其他防腐劑復(fù)配使用能增強(qiáng)其抑菌作用，擴(kuò)大抑菌范圍。利用Nisin不抑制酵母菌的特性，可被用于啤酒、果酒等酒精飲料中，防止乳酸菌引起的酸敗。賀松等[8]證明Nisin對(duì)乳品工業(yè)常用的乳酸菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，抑菌效果持久，可達(dá)30～48 h。近年來也有研究表明，在一定條件下，如冷凍、加熱、低pH等，Nisin可以抑制一些革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等。Khan等[9]研究表明，在pH 5～6條件下，當(dāng)一定濃度的Nisin與EDTA結(jié)合時(shí)，可以抑制大腸桿菌、李斯特氏菌的生長(zhǎng)。

1.4 在調(diào)味品中的應(yīng)用

作為一種天然防腐劑，Nisin已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在乳制品、肉制品、罐頭食品、啤酒和果汁飲料中，在調(diào)味品中的應(yīng)用研究也有報(bào)道。在調(diào)味品中應(yīng)用，Nisin的主要功效為：(1)建立復(fù)配型防腐劑，發(fā)揮多種防腐劑的互補(bǔ)增效作用，增強(qiáng)抑菌效果，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，如姜元榮等[10]將Nisin和納他霉素復(fù)配應(yīng)用于醬油防腐，可降低MIC至8 μg/kg，有效抑制醬油的霉變，延長(zhǎng)貨架期保存時(shí)間；(2)降低滅菌溫度，縮短熱處理時(shí)間，降低高溫對(duì)食品營養(yǎng)和感官的影響，如李增利等[11]研究表明Nisin可代替化學(xué)防腐劑用于醬油的防腐保鮮，減輕醬油的巴氏滅菌強(qiáng)度，保持醬油原有營養(yǎng)成分、風(fēng)味、色澤，延長(zhǎng)貨架期；(3)酸性熱穩(wěn)定，對(duì)食品色、香、味、口感無影響。

除了在成品中添加Nisin抑制微生物生長(zhǎng)外，也可在發(fā)酵過程中加入，這優(yōu)于化學(xué)防腐劑的特性。如在白酒發(fā)酵過程中加入Nisin，可有效降低白酒總酸，抑制白酒發(fā)酵中乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，控制白酒醪液中乳酸、乳酸乙酯的生成，提高白酒品質(zhì)[12]；而醬油等調(diào)味品由多菌種天然釀造而成，發(fā)酵過程中添加Nisin也可抑制特定菌種或雜菌對(duì)品質(zhì)的影響。

在其他調(diào)味品應(yīng)用上，Nisin主要是與其他防腐劑進(jìn)行復(fù)配使用，而非單一添加應(yīng)用，因此后續(xù)在開發(fā)Nisin防腐效果上，應(yīng)采用復(fù)配型防腐劑。

2 聚賴氨酸

2.1 理化性質(zhì)

ε-聚賴氨酸(ε-PL)是由放線菌通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)的一種同型氨基酸聚合物，是一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其由L-賴氨酸的ε-NH2和α-COOH縮合而成，分子量約為3500 Da[13]。ε-PL多以鹽酸鹽形式存在，其成品為淡黃色粉末，在水中溶解度較大，但是難溶于有機(jī)溶劑。ε-PL水溶液略有苦味，無其他不良口感；熱穩(wěn)定性好，在高溫加熱條件下，如120 ℃加熱處理20 min，均保持抑菌能力。不同聚合度ε-PL具有不同的抑菌活性，目前研究表明當(dāng)ε-PL聚合度為28～35時(shí)，其抑菌活性最好，當(dāng)聚合度低于10時(shí)，則失去抑菌活性[14]。ε-聚賴氨酸是由L-賴氨酸聚合而成，進(jìn)入人體后，能夠很快被人體消化分解為賴氨酸，而賴氨酸是食品中需要強(qiáng)化的氨基酸，同時(shí)也是人體必需的8種氨基酸之一，因此聚賴氨酸是一種非常安全的微生物抑菌劑，并且能夠提供給人體營養(yǎng)。

2.2 抑菌機(jī)制

目前已有研究表明，ε-PL是通過靜電吸附作用結(jié)合于細(xì)胞表面，然后通過一系列的反應(yīng)使細(xì)胞死亡或自溶。ε-PL的作用方式主要是改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變細(xì)胞形態(tài)，使磷脂雙分子層彎曲或形成囊泡等，使細(xì)胞膜功能紊亂，阻止胞內(nèi)外的物質(zhì)交流和轉(zhuǎn)換或抑制RAN轉(zhuǎn)錄等，從而導(dǎo)致細(xì)胞自溶或者死亡。Ye等[15]研究表明，當(dāng)以ε-PL處理E.coliO157∶H7時(shí)，ε-PL首先與細(xì)胞膜相結(jié)合，從而改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性，阻礙細(xì)胞膜內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生氧化壓力和SOS反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生自溶。Hyldgaard等[16]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ε-PL不僅能夠與細(xì)胞膜相結(jié)合，還能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，直接影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，或影響細(xì)胞呼吸作用，改變其代謝功能，從細(xì)胞內(nèi)部誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.3 抑菌特性

ε-PL的抑菌譜較廣，對(duì)絕大部分微生物均具有抑菌作用，其中對(duì)革蘭氏陽性和陰性菌、細(xì)菌、霉菌的抑制效果最強(qiáng)，在100 μg/mL以下就能達(dá)到較好的抑菌效果，對(duì)其他微生物抑菌作用根據(jù)不同體系抑菌強(qiáng)弱不同。Delihas等[17]研究表明，ε-PL對(duì)各種細(xì)菌都具有抑菌作用，其中分期桿菌抑菌效果最強(qiáng)，其他細(xì)菌抑菌效果稍弱，但是都能達(dá)到良好的殺菌作用。ε-PL對(duì)微生物孢子也具有顯著抑制作用，如Hiraki等[18]以B.coagulans,B.stearothermophilus和B.subtilis3種芽孢桿菌作為研究對(duì)象，研究結(jié)果表明：ε-PL能夠有效抑制孢子的萌發(fā)，其抑制濃度分別為12.5，2.5，12.5 μg/mL。在堿性條件下，ε-PL抑菌活性大幅下降，這是因?yàn)棣?PL等電點(diǎn)在9.0左右，不能通過靜電吸附作用在微生物上，進(jìn)而引起殺菌作用，而在中性和微酸性環(huán)境中具有極強(qiáng)抑菌活性。ε-PL熱穩(wěn)定性較好，Hu Y T等[19]發(fā)現(xiàn)ε-PL經(jīng)高溫處理后，不僅能夠保持抗菌性，還有很強(qiáng)的乳化特性，不受高濃度食鹽影響。此外，還具有水溶性好，不影響食品風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)。

2.4 在調(diào)味品中的應(yīng)用

我國于2014年批準(zhǔn)聚賴氨酸作為食品防腐劑在食品中使用，目前其在調(diào)味品中的應(yīng)用研究較少。由于ε-PL具有廣譜抑菌性特點(diǎn)，在調(diào)味品中可單獨(dú)添加應(yīng)用，如在醬腌菜中，單獨(dú)添加聚賴氨酸60 μg/mL時(shí)，可以完全抑制腐敗細(xì)菌Bacillussubtilis和Bacillusthurinqiensis生長(zhǎng)，抑菌效果優(yōu)于化學(xué)防腐劑(苯甲酸鈉和山梨酸鉀)；在醬油加工的調(diào)味雞飯的調(diào)味液中添加0.12%的ε-PL，浸漬雞肉后，在30 ℃保存也能大大抑制酵母菌等增值，延長(zhǎng)保存期。

為進(jìn)一步提高抑菌活性，降低使用量，擴(kuò)大抑菌譜等，ε-PL通常與其他防腐劑復(fù)配使用，協(xié)同抑菌。程濤等[20]研究表明聚賴氨酸在食醋中的最佳用量為60 mg/kg，并且聚賴氨酸與EDTA、山梨酸鉀作為復(fù)合防腐劑時(shí)，抑菌率達(dá)96%以上，能有效延長(zhǎng)食醋保質(zhì)期。

添加ε-PL除了具有防腐作用外，還有利于保持產(chǎn)品色澤。秦蕓樺等[21]采用ε-PL對(duì)鮮切竹筍進(jìn)行處理，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理過的鮮切竹筍L值和a值均高于對(duì)照，有利于保持竹筍色澤。

在其他食品如米飯、面條、湯類和熟蔬菜中，聚賴氨酸被廣泛應(yīng)用，如張春紅等[22]研究表明，添加ε-PL濕面條保鮮時(shí)間比化學(xué)防腐劑延長(zhǎng)了20%，并且使用價(jià)格低于化學(xué)防腐劑；在冷鮮肉保藏上，李迎秋將牛肉經(jīng)過ε-PL處理后，不僅能夠有效抑制微生物的生長(zhǎng)，還能保持牛肉的色澤，減少蛋白質(zhì)的損失，其最佳處理濃度為1.25%。因此，ε-PL被廣泛應(yīng)用于各種食品中，其在調(diào)味品中也具有廣泛的應(yīng)用前景和巨大的市場(chǎng)價(jià)值。

3 納他霉素

3.1 理化性質(zhì)

納他霉素是一種多烯大環(huán)內(nèi)脂類抗菌劑，外觀呈白色或奶油色，為無味結(jié)晶粉末，相對(duì)分子量為665.75。納他霉素是一種兩性物質(zhì)，分子中含有酸性、堿性兩種基團(tuán)，等電點(diǎn)為pH 6.5。其微溶于水和有機(jī)溶劑中，難溶于大部分非極性有機(jī)溶劑，室溫下水中的溶解度為30～100 mg/L。在pH 4.5～9之間非常穩(wěn)定，在極端pH條件下會(huì)迅速失活，但是對(duì)其抗真菌活性沒有明顯影響。熱穩(wěn)定性好，121 ℃加熱30 min，活性幾乎無損失，但是對(duì)紫外線敏感，不宜與光接觸。一些氧化劑(過氧化氫、漂白粉)和重金屬(鐵、鉛、汞等)也會(huì)影響納他霉素的活性。

3.2 抑菌機(jī)制

納他霉素的抑菌機(jī)理主要是通過納他霉素的疏水性部分與細(xì)胞膜表面的甾醇類化合物相結(jié)合，主要以范德華力作為引力，形成一種復(fù)合物(抗生素-甾醇復(fù)合物)。這種復(fù)合物的形成能夠改變細(xì)胞質(zhì)的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)、ATP、氨基酸、蛋白質(zhì)等重要物質(zhì)滲漏，或引起胞內(nèi)一系列化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而使細(xì)胞死亡。Vimr通過等溫滴定比色法和直接結(jié)合法的研究顯示，納他霉素可專一性地與細(xì)胞膜中的麥角固醇結(jié)合，與小囊泡形成顯著的相互作用，而不與不含甾醇的小囊泡發(fā)生相互作用[23]。另外也有研究表明，納他霉素特異性地結(jié)合甾醇后，并沒有改變細(xì)胞膜的通透性，而是以一種未知的機(jī)制來抑制真菌的生長(zhǎng)[24]。納他霉素的抑菌機(jī)制與麥角固醇存在密切關(guān)系，因此，那他霉素的抑菌活性主要取決于微生物的細(xì)胞壁或細(xì)胞上是否存在類似固醇化合物，這是其抗菌的關(guān)鍵基礎(chǔ)。

3.3 抑菌特性

納他霉素對(duì)幾乎所有的霉菌和酵母菌都具有抗性，但是對(duì)細(xì)菌和病毒無效。在抑菌效果上，納他霉素抑菌作用比山梨酸鉀強(qiáng)100～200倍，如大部分霉菌在納他霉素0.5 μg/mL以下時(shí)被完全抑制，而酵母菌需要在5 μg/mL濃度才會(huì)被抑制。孫啟華等[25]通過試管稀釋法和瓊脂稀釋法對(duì)納他霉素的抑菌效果研究表明，納他霉素對(duì)所試黃曲霉菌、青霉菌和酵母菌具有較強(qiáng)的抑制作用。Erich等[26]研究表明，經(jīng)過人為誘導(dǎo)，真菌對(duì)納他霉素幾乎不形成抗性，這主要是由于納他霉素對(duì)真菌具有較強(qiáng)抑菌活性。由于納他霉素對(duì)細(xì)菌不起作用，可直接加到酸奶等發(fā)酵品中，從而抑制產(chǎn)品中霉菌、酵母菌等有害真菌的繁殖。此外，Ray報(bào)道納他霉素能減少黃曲霉中的黃曲毒素、赭曲霉中的赭曲霉素和青霉菌中的青霉素的產(chǎn)生，減少真菌毒素對(duì)人類造成的危害[27]。

3.4 在調(diào)味品中的應(yīng)用

納他霉素是一種抗真菌制劑，對(duì)霉菌和酵母菌具有極強(qiáng)的抑制作用，因此在醬油、食醋等調(diào)味品中單獨(dú)添加納他霉素，可防止霉菌和酵母菌引起的變質(zhì)。陸曉濱等[28]研究了納他霉素在醬油中的應(yīng)用，當(dāng)納他霉素添加量為15 mg/kg時(shí)，能夠有效抑制醬油中耐鹽性酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，防止白花的出現(xiàn)，且納他霉素使用成本低，對(duì)醬油的品質(zhì)和風(fēng)味無影響[29]。同時(shí)，在蠔油中添加納他霉素，可以有效抑制蠔油的霉變，延長(zhǎng)保質(zhì)期達(dá)4周以上。姚勇芳等[30]研究表明納他霉素在醬油中應(yīng)用效果良好，能有效抑制霉菌生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品貨架期。

調(diào)味品應(yīng)用具有使用頻繁、常溫儲(chǔ)存、易暴露空氣等特點(diǎn)，易感染除真菌外的細(xì)菌等雜菌，因此實(shí)際應(yīng)用上納他霉素不能作為單一防腐劑使用，需與其他防腐劑協(xié)同作用。丁培峰等[31]研究表明，在醬油中添加任何一種天然防腐劑(納他霉素、乳酸鏈球菌素、茶多酚)，只能起到部分抑菌作用，不能達(dá)到醬油保鮮效果，將天然防腐劑復(fù)配后，利用各自抑菌互補(bǔ)的特性，能夠抑制貨架期內(nèi)微生物的增殖。其他研究也表明，納他霉素和茶多酚復(fù)配后使用防腐效果優(yōu)于山梨酸鉀化學(xué)防腐劑，并可提高醬油的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能[32]。

納他霉素也可在發(fā)酵過程中添加，抑制雜菌生長(zhǎng)，促進(jìn)優(yōu)勢(shì)菌群生長(zhǎng)繁殖。韓德權(quán)[33]將納他霉素應(yīng)用于酸菜發(fā)酵過程中，酵母菌、霉菌等雜菌的生長(zhǎng)被抑制，而乳酸菌生長(zhǎng)不受影響，使產(chǎn)品香氣明顯改善，酸菜的感官品質(zhì)明顯提高。

此外，在檢測(cè)方法上，劉超等[34]通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法能夠準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)出醬油中納他霉素含量，該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。

4 展望

近年來，隨著消費(fèi)者對(duì)綠色添加劑的關(guān)注，天然防腐劑代替化學(xué)防腐劑是調(diào)味品行業(yè)未來發(fā)展的趨勢(shì)。目前，天然防腐劑在食品行業(yè)已經(jīng)逐漸投入實(shí)際應(yīng)用，本文所述的3種微生物源防腐劑被美國、日本、韓國等國家廣泛應(yīng)用在食品防腐上，除了改善食品的保質(zhì)期和安全性外，也有利于保持食品品質(zhì)營養(yǎng)和開發(fā)新產(chǎn)品。國內(nèi)在生物防腐劑上的研究起步較晚，雖然已應(yīng)用在不同食品上，但是在調(diào)味品上的實(shí)際應(yīng)用還未見報(bào)道。這主要是由于生物防腐劑的大規(guī)模推廣應(yīng)用還存在許多問題，如在實(shí)際食品體系中生物防腐劑的抑菌水平、單一防腐劑應(yīng)用的局限性等。通過加深生物防腐劑的研發(fā)和應(yīng)用，根據(jù)不同產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝、配方和貯藏環(huán)境等不同，開發(fā)出不同復(fù)合型生物防腐劑，并且精確評(píng)估其抑菌作用，保證消費(fèi)者的健康飲食。

除了本文所陳述的3種常見微生物源食品防腐劑外，越來越多的天然防腐劑被開發(fā)應(yīng)用，如紅曲、殼聚糖、抗菌肽等。隨著對(duì)抗菌物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、抑菌機(jī)理和抑菌性的不斷深入研究，高效、安全、廉價(jià)的食品防腐劑將被逐漸應(yīng)用，大大提高行業(yè)品質(zhì)。

綜上所述，微生物源食品防腐劑將會(huì)得到廣泛應(yīng)用，促進(jìn)調(diào)味品行業(yè)產(chǎn)業(yè)升級(jí)。